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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PEG介导原生质体遗传转化的问题，求高手解答！！
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yini4632

铁虫 (初入文坛)

[求助] PEG介导原生质体遗传转化的问题，求高手解答！！

实验室以前用于农杆菌介导遗传转化的双元载体，用于构建突变体库的，含有GFP+潮霉素基因，我想用来检测下自己建立的PEG介导的原生质体转化体系，不知道到可以不？对于原生质体介导的遗传转化总是弄不清楚，质粒进入原生质体后，是不是整个质粒随机插入到基因组中。农杆菌中有vir基因，可以切除T-DNA然后随机插入，原生质体中质粒整合到基因组中是怎么整合上去的，跟农杆菌介导区别在哪里？迷糊中。。。。。还有用于农杆菌介导的基因敲除质粒，含有同源臂的质粒，农杆菌介导后有同源重组和随机插入2种转化子，那这种质粒用原生质体介导是不是也会出现同源重组和随机插入的转化子？

[ Last edited by yini4632 on 2013-10-8 at 20:03 ]
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1楼 2013-10-08 19:16:37
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yini4632

铁虫 (初入文坛)
求帮助~~~~~~~~~~~~~
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2楼2013-10-09 15:00:34
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zgb1982

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
这个不是很懂啊。不过我觉得脓杆菌主要是利用其侵染性使质粒进入细胞内吧。感觉和直接转化原生质体是一样原理。
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3楼2013-10-09 21:18:17
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547star

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-10-11 00:03:47
印象是农杆菌在乙酰丁香酮诱导下，侵染，通过Ti/Ci上的一个蛋白与原生质体细胞形成通道，把T-DNA区DNA通过通道转入原生质体细胞，DNA转进去后，有的就发生整合，在选择压力下，可以筛选出来，再进一步鉴定确认确实发生整合了。
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为什么
4楼2013-10-09 22:23:37
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咆哮的白菜

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-10-11 00:03:53
农杆菌介导是通过农杆菌的侵染作用将质粒转到目的细胞内，PEG介导是通过氯化钙和PEG对DNA的附着沉积和对细胞质膜的破坏作用，通过热击电击或其他刺激作用使DNA片段进入到原生质体内。不知道你是要验证你的转化方法是否正确还是转化后的问题。转化完成以后，在细胞内的作用机制应该是一样的，至于会不会出现两种结果，我认为是肯定的，肯定会有随机插入的和同源交换的。
　　个人意见，欢迎讨论。
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姥姥不疼，舅舅不爱
5楼2013-10-10 23:33:59
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yini4632

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 咆哮的白菜 at 2013-10-10 23:33:59
农杆菌介导是通过农杆菌的侵染作用将质粒转到目的细胞内，PEG介导是通过氯化钙和PEG对DNA的附着沉积和对细胞质膜的破坏作用，通过热击电击或其他刺激作用使DNA片段进入到原生质体内。不知道你是要验证你的转化方法是 ...

因为看一些农杆菌介导的原理，好像是农杆菌本身除了能侵染细胞，释放质粒进入，还有自身特殊的vir基因，可以切除质粒上的TNDA，然后插入到基因组中。这个vir基因好像是农杆菌自身特有的，导入的质粒上没有，如果直接用原生质体转入质粒，没有同样的机制去切除TDNA，那这个质粒上的片段怎么插入基因组或者整个质粒插入？
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6楼2013-10-15 10:39:46
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咆哮的白菜

金虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by yini4632 at 2013-10-15 10:39:46
因为看一些农杆菌介导的原理，好像是农杆菌本身除了能侵染细胞，释放质粒进入，还有自身特殊的vir基因，可以切除质粒上的TNDA，然后插入到基因组中。这个vir基因好像是农杆菌自身特有的，导入的质粒上没有，如果直 ...

对于随机插入的原理我确实不清楚，但是在做基因敲除的时候，转入细胞内的DNA片段除了同源交换还是有机会整合到基因组中的。至于整个质粒在细胞内的整合应该是没有问题的，好像有些原核表达和真核表达的原理也是质粒上的片段整合到基因组上再表达的，但原理我也不是很清楚，你可以查一下分子克隆那本大厚书。
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姥姥不疼，舅舅不爱
7楼2013-10-15 21:15:28
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qyf0904

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

请问，PEG介导法中，PEG 的聚合度对转化效率影响吗？真菌原生质体的转化用多大聚合度？
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8楼2013-11-25 12:31:08
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Biologyyu

禁虫
本帖内容被屏蔽
9楼2022-07-25 12:14:05
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