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xingyun789

金虫 (小有名气)

[求助] 有关Western Blot 结果方面的求助 已有2人参与

以下是我最近做的WB结果，其中，红方框内是我的目的条带，下面的那条带是非特异带，箭头所指处有一些背景，我封闭的时间是1.5个小时，用的是5%脱脂奶粉，一抗1:500 （鼠源多抗，效价不是很高），4℃孵育过夜，然后TBST洗脱3次，每次10min，二抗1:1000常温孵育2小时，然后TBST洗脱3次，每次10分钟，完毕后用ECL发光法进行曝光，黑暗下发光很弱，因此曝光时间约2min，请问，出现这样的情况该如何进行改进，谢谢！

有关Western Blot 结果方面的求助
360截图20150427091728531.jpg
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1楼 2015-04-27 09:25:19
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WHABnew

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2015-04-28 09:24:25
一、二抗室温一小时已经足够了，不管是冬天还是夏天，如果室温太高建议可以45min；二、，目的条带比非特异性还强，二抗可以看下说明书的建议稀释浓度，浓度可以再低点，提高一抗浓度；还有就是洗的时间可以一次5-6min，多洗一到两次。另外一个小建议就是做的时候处理膜要小心点，感觉膜还比较脏。建议在这之前先查下你的蛋白类型，是否是磷酸化蛋白，如果是磷酸化蛋白封闭建议用1%的胎牛血清，希望对楼主有用
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2楼2015-04-27 14:59:29
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2015-04-28 09:24:30
一抗二抗封闭一小时即可（封闭的时候在震床上轻轻摇晃或轻微震荡），每次用PBS洗的时候也要轻轻晃动，牛奶封闭的时间一小时左右，还有加入抗体4度过夜，可以改为室温震荡封闭1小时，你的整体用时都偏长，可以减少时间，过程中注意每一步的洗涤，虽然有背景，但是不算严重
这是有关WB问题，总结的挺好，可以看看http://www.detaibio.com/material-western-blot-faq.html
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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
3楼2015-04-27 15:17:48
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