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xxyysong

新虫 (初入文坛)

[求助] 设计带histag的引物 已有3人参与

各位师兄师姐, 我要给李斯特菌的一段目的基因带上N-terminal的histag再转到一个质粒里。我设计的引物是Forward: GGC+酶切位点+目的基因
Reverse:GGC+酶切位点+histag序列+目的基因。

我的问题是需要在引物里设计起始密码子和终止密码子吗?histag的序列CAT CAC都可以吗?还需要添加一些保护的序列吗?还有就是我找不到我要转入的质粒的序列图,只知道酶切位点。

谢谢!
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潇潇杨雨125

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
要看你的目的是什么了?过表达吗?

[ 发自小木虫客户端 ]
2楼2015-04-08 00:54:01
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xxyysong

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 潇潇杨雨125 at 2015-04-08 00:54:01
要看你的目的是什么了?过表达吗?

就是表达目的蛋白在质粒里。 加histag是为了能过Ni-NTA柱子纯化。
3楼2015-04-08 01:32:44
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lxzk

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2015-04-08 09:32:19
xxyysong: 金币+3, ★★★很有帮助, 谢谢 2015-04-09 01:23:04
有his的那侧要加起始/终止密码子,取代原来基因上的,另外一侧不用加,就用原来的。his密码子都可以,其它就按你设计的,不用额外的保护碱基了。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
4楼2015-04-08 06:18:08
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nemo88

禁虫 (小有名气)

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-04-08 23:08:42
xxyysong: 金币+7, ★★★★★最佳答案, 谢谢 2015-04-09 01:23:20
本帖内容被屏蔽

5楼2015-04-08 09:54:38
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xxyysong

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
5楼: Originally posted by nemo88 at 2015-04-08 09:54:38
Histag不用保护碱基,但是你酶切位点的保护碱基要查清楚,都是三个吗,可以对一下酶切保护碱基表,我一般稳妥加6个
要去掉你目的基因上的终止密码子,然后在histag和酶切位点之间加终止密码子
不用知道质粒序列, ...

起始密码子也需要加吗 谢谢
6楼2015-04-09 01:26:47
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xxyysong

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
5楼: Originally posted by nemo88 at 2015-04-08 09:54:38
Histag不用保护碱基,但是你酶切位点的保护碱基要查清楚,都是三个吗,可以对一下酶切保护碱基表,我一般稳妥加6个
要去掉你目的基因上的终止密码子,然后在histag和酶切位点之间加终止密码子
不用知道质粒序列, ...

我还有一个问题 怎样去掉终止密码子呀 谢谢
7楼2015-04-09 02:39:19
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ladtalent

至尊木虫 (著名写手)

引用回帖:
7楼: Originally posted by xxyysong at 2015-04-09 02:39:19
我还有一个问题 怎样去掉终止密码子呀 谢谢...

overlap PCR 去掉就可以了  如果histag不长直接设计带histag的primerPCR就好了
8楼2015-04-09 12:54:15
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nemo88

禁虫 (小有名气)

本帖内容被屏蔽

9楼2015-04-16 17:07:40
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