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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 设计带histag的引物
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xxyysong

新虫 (初入文坛)

[求助] 设计带histag的引物 已有3人参与

各位师兄师姐， 我要给李斯特菌的一段目的基因带上N-terminal的histag再转到一个质粒里。我设计的引物是Forward: GGC+酶切位点+目的基因
Reverse：GGC+酶切位点+histag序列+目的基因。

我的问题是需要在引物里设计起始密码子和终止密码子吗？histag的序列CAT CAC都可以吗？还需要添加一些保护的序列吗？还有就是我找不到我要转入的质粒的序列图，只知道酶切位点。

谢谢！
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1楼 2015-04-08 00:27:00
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潇潇杨雨125

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
要看你的目的是什么了？过表达吗？

[ 发自小木虫客户端 ]
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2楼2015-04-08 00:54:01
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xxyysong

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 潇潇杨雨125 at 2015-04-08 00:54:01
要看你的目的是什么了？过表达吗？

就是表达目的蛋白在质粒里。 加histag是为了能过Ni-NTA柱子纯化。
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3楼2015-04-08 01:32:44
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lxzk

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2015-04-08 09:32:19
xxyysong: 金币+3, ★★★很有帮助, 谢谢 2015-04-09 01:23:04
有his的那侧要加起始／终止密码子，取代原来基因上的，另外一侧不用加，就用原来的。his密码子都可以，其它就按你设计的，不用额外的保护碱基了。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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4楼2015-04-08 06:18:08
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nemo88

禁虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-04-08 23:08:42
xxyysong: 金币+7, ★★★★★最佳答案, 谢谢 2015-04-09 01:23:20
本帖内容被屏蔽
5楼2015-04-08 09:54:38
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xxyysong

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by nemo88 at 2015-04-08 09:54:38
Histag不用保护碱基，但是你酶切位点的保护碱基要查清楚，都是三个吗，可以对一下酶切保护碱基表，我一般稳妥加6个
要去掉你目的基因上的终止密码子，然后在histag和酶切位点之间加终止密码子
不用知道质粒序列， ...

起始密码子也需要加吗 谢谢
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6楼2015-04-09 01:26:47
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xxyysong

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by nemo88 at 2015-04-08 09:54:38
Histag不用保护碱基，但是你酶切位点的保护碱基要查清楚，都是三个吗，可以对一下酶切保护碱基表，我一般稳妥加6个
要去掉你目的基因上的终止密码子，然后在histag和酶切位点之间加终止密码子
不用知道质粒序列， ...

我还有一个问题 怎样去掉终止密码子呀 谢谢
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7楼2015-04-09 02:39:19
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ladtalent

至尊木虫 (著名写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by xxyysong at 2015-04-09 02:39:19
我还有一个问题 怎样去掉终止密码子呀 谢谢...

overlap PCR 去掉就可以了  如果histag不长直接设计带histag的primerPCR就好了
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8楼2015-04-09 12:54:15
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nemo88

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
9楼2015-04-16 17:07:40
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