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七小艾

新虫 (小有名气)

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专业: 蛋白质组学

[求助] SDS-PAGE图求分析已有6人参与

图中是放线菌菌体破碎上清的SDS-PAGE图，样品最终是用来跑双向的，所以为了减少蛋白降解提高蛋白溶出率，用了不同的细胞裂解方法和几种不同的裂解液，结果如图所示。
A/B/C/D所用裂解液：Tris-HCl 50mM pH7.4, protease inhibitor cocktail
E:Tris-HCl 50mM pH7.4, protease inhibitor cocktail, 8M 尿素
F：Tris-HCl 50mM pH7.4, protease inhibitor cocktail， 7M尿素，2M硫脲
G：Tris-HCl 50mM pH7.4, protease inhibitor cocktail，2%SDS（终浓度，SDS细胞破碎后加，65℃处理10min）

细胞破碎方法：A涡旋振荡，B超声，CDEFG机械均质

想请教高手几个问题
1、用SDS处理后的样品蛋白胶为什么会跑成这样？上面大分子量的蛋白全没了，下面糊成一片？做过不加SDS进行65℃处理，虽然蛋白有一定程度降解，但大分子量的蛋白条带还是有的，说明不是高温造成的结果。不知道样品中过量的SDS对跑胶有没有什么影响？
2、尿素和硫脲对SDS-PAGE是不是也有影响？因为加了尿素和硫脲的样品蛋白胶颜色反而不如不加的，但是蛋白浓度测定（Bradford法和BCA法都测过）结果显示加了尿素和硫脲的蛋白浓度较高，是不是尿素和硫脲对Bradford法和BCA法都有干扰（硫脲对BCA有干扰是确定的）？
3、蛋白胶每次跑出来下面小分子量部分都没有清晰的条带，而是糊成一片的，这是什么原因？

IMG_0578_副本.jpg

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1楼 2015-04-07 15:46:54

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huangdan1003

新虫 (初入文坛)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
七小艾: 金币+5, ★★★很有帮助 2015-04-20 16:29:06

1。样品中过量的SDS会使蛋白分子带负电荷，电泳速度可想而知~~，另外处理二维电泳蛋白样品不需要加SDS。推荐裂解液：8M 尿素,
4% CHAPS, 1%IPG buffer, protease inhibitor cocktail
2.做一维的蛋白电泳样品预处理的时候需要高温水煮变性，尿素和硫脲会在高温时候转化成尿酸，但是不影响在二维电泳时候的效果。
3.一般二维电泳蛋白样品都是全蛋白电泳，而细胞中本来小分子蛋白就很多，再加上还有部分大分子蛋白降解成小分子，模糊成一片很正常。其实不推荐用这种方法来做二维的预实验。。。二维电泳蛋白样品处理最怕的就是离子的干扰，把这个问题解决了，一般问题不大。。