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七小艾

新虫 (小有名气)

[求助] SDS-PAGE图求分析 已有6人参与

图中是放线菌菌体破碎上清的SDS-PAGE图,样品最终是用来跑双向的,所以为了减少蛋白降解提高蛋白溶出率,用了不同的细胞裂解方法和几种不同的裂解液,结果如图所示。
A/B/C/D所用裂解液:Tris-HCl 50mM pH7.4, protease inhibitor cocktail
E:Tris-HCl 50mM pH7.4, protease inhibitor cocktail, 8M 尿素
F:Tris-HCl 50mM pH7.4, protease inhibitor cocktail, 7M尿素,2M硫脲
G:Tris-HCl 50mM pH7.4, protease inhibitor cocktail,2%SDS(终浓度,SDS细胞破碎后加,65℃处理10min)

细胞破碎方法:A涡旋振荡,B超声,CDEFG机械均质

想请教高手几个问题
1、用SDS处理后的样品蛋白胶为什么会跑成这样?上面大分子量的蛋白全没了,下面糊成一片?做过不加SDS进行65℃处理,虽然蛋白有一定程度降解,但大分子量的蛋白条带还是有的,说明不是高温造成的结果。不知道样品中过量的SDS对跑胶有没有什么影响?
2、尿素和硫脲对SDS-PAGE是不是也有影响?因为加了尿素和硫脲的样品蛋白胶颜色反而不如不加的,但是蛋白浓度测定(Bradford法和BCA法都测过)结果显示加了尿素和硫脲的蛋白浓度较高,是不是尿素和硫脲对Bradford法和BCA法都有干扰(硫脲对BCA有干扰是确定的)?
3、蛋白胶每次跑出来下面小分子量部分都没有清晰的条带,而是糊成一片的,这是什么原因?

SDS-PAGE图求分析
IMG_0578_副本.jpg
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huangdan1003

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
七小艾: 金币+5, ★★★很有帮助 2015-04-20 16:29:06
1。样品中过量的SDS会使蛋白分子带负电荷,电泳速度可想而知~~,另外处理二维电泳蛋白样品不需要加SDS。推荐裂解液:8M 尿素,
4% CHAPS, 1%IPG buffer, protease inhibitor cocktail
2.做一维的蛋白电泳样品预处理的时候需要高温水煮变性,尿素和硫脲会在高温时候转化成尿酸,但是不影响在二维电泳时候的效果。
3.一般二维电泳蛋白样品都是全蛋白电泳,而细胞中本来小分子蛋白就很多,再加上还有部分大分子蛋白降解成小分子,模糊成一片很正常。其实不推荐用这种方法来做二维的预实验。。。二维电泳蛋白样品处理最怕的就是离子的干扰,把这个问题解决了,一般问题不大。。
8楼2015-04-12 14:53:25
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bao可雅

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你没有marker吗?marker跑的如何?
2楼2015-04-08 14:18:52
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七小艾

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by bao可雅 at 2015-04-08 14:18:52
你没有marker吗?marker跑的如何?

Marker用完了就没跑,不过以前做的时候Marker是正常的,但是下面小分子量部分也是没有清晰的条带,而是糊成一片的
3楼2015-04-08 16:02:16
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琼琼雨露

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
是不是电泳时间太长,小分子蛋白都跑出去了
4楼2015-04-08 19:20:50
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