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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 长片段连接，连接不上，求指导
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萧峰寒水

铜虫 (初入文坛)

[求助] 长片段连接，连接不上，求指导 已有4人参与

目的片段大约3000bp，载体全长9342bp，酶切位点基本是在MCS的两头，距离挺远。分别用solution 1和T4 连接酶都试过了，载体和片段的摩尔比也调过。但是涂板后，不是不长，就是张的少。用加酶切位点的引物检测只有引物二聚体，到底是怎么回事？
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1楼 2015-04-06 11:10:53
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萧峰寒水

铜虫 (初入文坛)
救命啊，要疯了
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2楼2015-04-06 11:14:08
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随风飘摇11

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
说的太笼统了，不好给你分析原因。你确定是连接的原因，不是酶切的原因？最好把体系，电泳图放上来

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天道酬勤
3楼2015-04-06 16:11:36
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dehong1573

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2015-04-27 11:23:39
很明显不是连接转化的问题啊，因为就算是原始质粒PCR产物也不应该是二聚体，应该有小片段的产物，所以首先要做的是调整你的PCR！
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科学永无止境,只有合作共享才能更好地……
4楼2015-04-07 08:10:26
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sh_9153

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2015-04-27 11:23:42
3000连9000应该不是很难，你把酶切确定一下，然后T4连接过夜转化应该会有结果的，再有就是你的感受态是不是保证效率，毕竟连上之后14K的载体，也需要好点的感受态
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5楼2015-04-09 11:29:22
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
菌液 PCR鉴定有时不准，最好提质粒酶切检测。

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6楼2015-04-09 16:55:48
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萧峰寒水

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2015-04-09 16:55:48
菌液 PCR鉴定有时不准，最好提质粒酶切检测。

提质粒酶切后，目的片段的大小不对
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7楼2015-04-25 14:34:30
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萧峰寒水

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by sh_9153 at 2015-04-09 11:29:22
3000连9000应该不是很难，你把酶切确定一下，然后T4连接过夜转化应该会有结果的，再有就是你的感受态是不是保证效率，毕竟连上之后14K的载体，也需要好点的感受态

感受态是商业感受态，直接购买的
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8楼2015-04-25 14:34:57
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萧峰寒水

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by dehong1573 at 2015-04-07 08:10:26
很明显不是连接转化的问题啊，因为就算是原始质粒PCR产物也不应该是二聚体，应该有小片段的产物，所以首先要做的是调整你的PCR！

难道要改变退火温度
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9楼2015-04-25 14:36:26
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三撇五撇

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

在保证载体和片段都酶切OK时，尝试T4连接过夜，转化后平板常温培养，成功率较高
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10楼2015-05-05 16:26:15
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