应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 长片段连接，连接不上，求指导
101/1返回列表
查看: 3594  |  回复: 9
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

萧峰寒水

铜虫 (初入文坛)

[求助] 长片段连接，连接不上，求指导 已有4人参与

目的片段大约3000bp，载体全长9342bp，酶切位点基本是在MCS的两头，距离挺远。分别用solution 1和T4 连接酶都试过了，载体和片段的摩尔比也调过。但是涂板后，不是不长，就是张的少。用加酶切位点的引物检测只有引物二聚体，到底是怎么回事？
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2015-04-06 11:10:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

萧峰寒水

铜虫 (初入文坛)
救命啊，要疯了
回复此楼
2楼2015-04-06 11:14:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

随风飘摇11

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
说的太笼统了，不好给你分析原因。你确定是连接的原因，不是酶切的原因？最好把体系，电泳图放上来

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
天道酬勤
3楼2015-04-06 16:11:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

dehong1573

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2015-04-27 11:23:39
很明显不是连接转化的问题啊，因为就算是原始质粒PCR产物也不应该是二聚体，应该有小片段的产物，所以首先要做的是调整你的PCR！
赞一下 回复此楼
科学永无止境,只有合作共享才能更好地……
4楼2015-04-07 08:10:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sh_9153

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2015-04-27 11:23:42
3000连9000应该不是很难，你把酶切确定一下，然后T4连接过夜转化应该会有结果的，再有就是你的感受态是不是保证效率，毕竟连上之后14K的载体，也需要好点的感受态
赞一下 回复此楼
5楼2015-04-09 11:29:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
菌液 PCR鉴定有时不准，最好提质粒酶切检测。

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
6楼2015-04-09 16:55:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

萧峰寒水

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2015-04-09 16:55:48
菌液 PCR鉴定有时不准，最好提质粒酶切检测。

提质粒酶切后，目的片段的大小不对
赞一下 回复此楼
7楼2015-04-25 14:34:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

萧峰寒水

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by sh_9153 at 2015-04-09 11:29:22
3000连9000应该不是很难，你把酶切确定一下，然后T4连接过夜转化应该会有结果的，再有就是你的感受态是不是保证效率，毕竟连上之后14K的载体，也需要好点的感受态

感受态是商业感受态，直接购买的
赞一下 回复此楼
8楼2015-04-25 14:34:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

萧峰寒水

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by dehong1573 at 2015-04-07 08:10:26
很明显不是连接转化的问题啊，因为就算是原始质粒PCR产物也不应该是二聚体，应该有小片段的产物，所以首先要做的是调整你的PCR！

难道要改变退火温度
赞一下 回复此楼
9楼2015-04-25 14:36:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

三撇五撇

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

在保证载体和片段都酶切OK时，尝试T4连接过夜，转化后平板常温培养，成功率较高
赞一下 回复此楼
10楼2015-05-05 16:26:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 萧峰寒水 的主题更新
101/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +3 ZYXdhzDAy9ZX 2026-09-28 3/150 2026-09-29 06:42 by ZvyPK8n6Nfki
[找工作] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +3 ZYXdhzDAy9ZX 2026-09-28 3/150 2026-09-29 06:34 by ZvyPK8n6Nfki
[找工作] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +3 ZYXdhzDAy9ZX 2026-09-28 3/150 2026-09-29 06:28 by ZvyPK8n6Nfki
[考博] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 ZYXdhzDAy9ZX 2026-09-28 3/150 2026-09-29 06:18 by ZvyPK8n6Nfki
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 tqUTOxClQUMF 2026-09-28 3/150 2026-09-28 23:46 by b8fCuTHqckEt
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 GDBe8tDZqE8z 2026-09-28 4/200 2026-09-28 23:19 by b8fCuTHqckEt
[考研] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 GDBe8tDZqE8z 2026-09-28 3/150 2026-09-28 23:12 by b8fCuTHqckEt
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 CfXuS1rDhLYN 2026-09-28 4/200 2026-09-28 22:55 by ez6fGg9abYaj
[公派出国] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +4 IDs3scOF0tjC 2026-09-28 4/200 2026-09-28 22:55 by ez6fGg9abYaj
[博后之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +4 IDs3scOF0tjC 2026-09-28 5/250 2026-09-28 22:45 by ez6fGg9abYaj
[有机交流] 同一个分子，一条来自文献，一条来自AI——不告诉你答案，你会选哪条？ +3 tianxiaoxian 2026-09-28 6/300 2026-09-28 22:44 by tianxiaoxian
[找工作] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +3 IDs3scOF0tjC 2026-09-28 5/250 2026-09-28 22:32 by ez6fGg9abYaj
[公派出国] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +3 IDs3scOF0tjC 2026-09-28 4/200 2026-09-28 22:28 by ez6fGg9abYaj
[博后之家] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +3 IDs3scOF0tjC 2026-09-28 3/150 2026-09-28 22:21 by ez6fGg9abYaj
[考博] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +3 IDs3scOF0tjC 2026-09-28 6/300 2026-09-28 22:15 by ez6fGg9abYaj
[论文投稿] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 CfXuS1rDhLYN 2026-09-28 3/150 2026-09-28 19:08 by 9lS3ad5oOymn
[考研] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +3 IDs3scOF0tjC 2026-09-28 4/200 2026-09-28 18:51 by 9lS3ad5oOymn
[找工作] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +4 IDs3scOF0tjC 2026-09-28 4/200 2026-09-28 17:30 by ZYXdhzDAy9ZX
[教师之家] 某top大学教授说“能够在市场中兑现的能力才是真能力”无比同意！ +7 zju2000 2026-09-26 8/400 2026-09-28 16:42 by beefly
[教师之家] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +3 GDBe8tDZqE8z 2026-09-28 3/150 2026-09-28 15:32 by ZYXdhzDAy9ZX
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭