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1277749856

新虫 (初入文坛)

[求助] 请PCR的问题 已有7人参与

大家好,我现在做普通PCR,跑电泳的结果一直不理想,希望大家给些意见,希望早点做出结果的,谢谢啦

体系(25μL)
ddH2O          12
primer1         5
primer2         5
2×buffer      62.5
Taq 酶           0.5
dNTP             10
模板              5
                            A               B                     C                  D
镁离子                  0              0.5                  1                  1.5
ddH20                  5              4.5                   4                 3.5
附件图片中温度为55摄氏度,已经做了54,55,56,57,60的退火温度,但结果一直都是这样,区别不大。

请PCR的问题
IMG_20150401_210152.jpg
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随风飘摇11

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
我怎么也看懂你的PCR体系啊?是25uL吗?我算不清楚…

[ 发自小木虫客户端 ]
天道酬勤
3楼2015-04-05 22:40:01
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普通回帖

ytt577313693

新虫 (初入文坛)

★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-04-07 22:56:00
我最近做PCR也会出现这样的拖带现象,我是做的梯度,慢慢试的退火温度,可能是引物的特异性不好,你把温度降低点。再试试我已经降到46度了。你可以往低调。我的师兄说可以降到40左右。如果出现目的条带可以回收胶再跑那样图就好看了。
2楼2015-04-05 21:13:41
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
同意三楼。。25ul是怎么算的
todayisdifficult,tomorrowismoredifficult,butthedayaftertomorrowisbeautiful
4楼2015-04-07 08:53:25
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1277749856

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 随风飘摇11 at 2015-04-05 22:40:01
我怎么也看懂你的PCR体系啊?是25uL吗?我算不清楚…

是呀,我做的是镁离子的梯度,做了四管
5楼2015-04-07 08:53:55
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1277749856

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by ytt577313693 at 2015-04-05 21:13:41
我最近做PCR也会出现这样的拖带现象,我是做的梯度,慢慢试的退火温度,可能是引物的特异性不好,你把温度降低点。再试试我已经降到46度了。你可以往低调。我的师兄说可以降到40左右。如果出现目的条带可以回收胶再 ...

不是温度越低,非特异性越强吗,降温可以吗,这个降温是根据什么下调的,我的能降到多少
6楼2015-04-07 08:56:03
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1277749856

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by ytt577313693 at 2015-04-05 21:13:41
我最近做PCR也会出现这样的拖带现象,我是做的梯度,慢慢试的退火温度,可能是引物的特异性不好,你把温度降低点。再试试我已经降到46度了。你可以往低调。我的师兄说可以降到40左右。如果出现目的条带可以回收胶再 ...

还有就是我已经得到我的目的条带了,就是图中的2Kb,但是他不够亮,我主要就是想要多一点的量,得到更多目的条带,请问有没有办法能帮助我提高目的条带的量
7楼2015-04-07 09:01:48
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1277749856

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 18761615793 at 2015-04-07 08:53:25
同意三楼。。25ul是怎么算的

就是前面的,从水到模板我做了5管,然后分装到四管,在和下面的水和镁离子中ABCD,加在一起一共25ul
8楼2015-04-07 09:06:14
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随风飘摇11

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by 1277749856 at 2015-04-07 08:53:55
是呀,我做的是镁离子的梯度,做了四管...

原谅我还是看不懂你的体系好吗?把一个PCR的体系放上来就一目了然了

[ 发自小木虫客户端 ]
天道酬勤
9楼2015-04-07 11:17:40
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随风飘摇11

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by 1277749856 at 2015-04-07 09:06:14
就是前面的,从水到模板我做了5管,然后分装到四管,在和下面的水和镁离子中ABCD,加在一起一共25ul...

终于仔细看了看,有个疑问就是你为什么要做镁离子的剃度?还有你是以什么为模板扩的?还有一个问题是,你的体系中buffer怎么用那么多?我们大都是buffer和dNTP的量是一样的。还有,我们的buffer就是含有镁离子的

[ 发自小木虫客户端 ]
天道酬勤
10楼2015-04-07 11:29:59
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