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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 请PCR的问题
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1277749856

新虫 (初入文坛)

[求助] 请PCR的问题 已有7人参与

大家好，我现在做普通PCR，跑电泳的结果一直不理想，希望大家给些意见，希望早点做出结果的，谢谢啦

体系（25μL）
ddH2O          12
primer1         5
primer2         5
2×buffer      62.5
Taq 酶           0.5
dNTP             10
模板              5
                            A               B                     C                  D
镁离子                  0              0.5                  1                  1.5
ddH20                  5              4.5                   4                 3.5
附件图片中温度为55摄氏度，已经做了54,55,56,57,60的退火温度，但结果一直都是这样，区别不大。

请PCR的问题
IMG_20150401_210152.jpg
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1楼 2015-04-04 16:41:05
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

随风飘摇11

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我怎么也看懂你的PCR体系啊？是25uL吗？我算不清楚…

[ 发自小木虫客户端 ]
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天道酬勤
3楼2015-04-05 22:40:01
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普通回帖

ytt577313693

新虫 (初入文坛)
★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-04-07 22:56:00
我最近做PCR也会出现这样的拖带现象，我是做的梯度，慢慢试的退火温度，可能是引物的特异性不好，你把温度降低点。再试试我已经降到46度了。你可以往低调。我的师兄说可以降到40左右。如果出现目的条带可以回收胶再跑那样图就好看了。
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2楼2015-04-05 21:13:41
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
同意三楼。。25ul是怎么算的
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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
4楼2015-04-07 08:53:25
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1277749856

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 随风飘摇11 at 2015-04-05 22:40:01
我怎么也看懂你的PCR体系啊？是25uL吗？我算不清楚…

是呀，我做的是镁离子的梯度，做了四管
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5楼2015-04-07 08:53:55
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1277749856

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ytt577313693 at 2015-04-05 21:13:41
我最近做PCR也会出现这样的拖带现象，我是做的梯度，慢慢试的退火温度，可能是引物的特异性不好，你把温度降低点。再试试我已经降到46度了。你可以往低调。我的师兄说可以降到40左右。如果出现目的条带可以回收胶再 ...

不是温度越低，非特异性越强吗，降温可以吗，这个降温是根据什么下调的，我的能降到多少
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6楼2015-04-07 08:56:03
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1277749856

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ytt577313693 at 2015-04-05 21:13:41
我最近做PCR也会出现这样的拖带现象，我是做的梯度，慢慢试的退火温度，可能是引物的特异性不好，你把温度降低点。再试试我已经降到46度了。你可以往低调。我的师兄说可以降到40左右。如果出现目的条带可以回收胶再 ...

还有就是我已经得到我的目的条带了，就是图中的2Kb，但是他不够亮，我主要就是想要多一点的量，得到更多目的条带，请问有没有办法能帮助我提高目的条带的量
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7楼2015-04-07 09:01:48
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1277749856

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 18761615793 at 2015-04-07 08:53:25
同意三楼。。25ul是怎么算的

就是前面的，从水到模板我做了5管，然后分装到四管，在和下面的水和镁离子中ABCD,加在一起一共25ul
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8楼2015-04-07 09:06:14
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随风飘摇11

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by 1277749856 at 2015-04-07 08:53:55
是呀，我做的是镁离子的梯度，做了四管...

原谅我还是看不懂你的体系好吗？把一个PCR的体系放上来就一目了然了

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天道酬勤
9楼2015-04-07 11:17:40
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随风飘摇11

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by 1277749856 at 2015-04-07 09:06:14
就是前面的，从水到模板我做了5管，然后分装到四管，在和下面的水和镁离子中ABCD,加在一起一共25ul...

终于仔细看了看，有个疑问就是你为什么要做镁离子的剃度？还有你是以什么为模板扩的？还有一个问题是，你的体系中buffer怎么用那么多？我们大都是buffer和dNTP的量是一样的。还有，我们的buffer就是含有镁离子的

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天道酬勤
10楼2015-04-07 11:29:59
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