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ZRFZYY

银虫 (正式写手)

[求助] 血清蛋白双向电泳

第一次做双向电泳，样品为绵羊血清（未去白蛋白、IGg），上样量240ug,IPG胶条是GE公司的：13cm,PH 3-10
等电聚焦条件：被动水化 15h
50V 2h
300V 3h
1000V 3h
3000V 3h
8000V 3h
8000V 80000vh
500v 10v
SDS-page条件：15mA/胶条，30min;45mA/胶条，至溴酚蓝跑至胶下沿。
不知道为什么会没有蛋白点，操作是按照GE公司双向电泳操作手册做的，希望知道原因的大侠帮助解释一下，不胜感谢！

血清蛋白双向电泳
20150317_155447.jpg
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用心做事
1楼 2015-03-18 11:29:05
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haze12344

银虫 (小有名气)
你的样品有没有跑过普通的SDS-PAGE？可以先取10μL跑个看看有没有条带
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生物你好
2楼2015-04-17 15:43:50
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ZRFZYY

银虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by haze12344 at 2015-04-17 15:43:50
你的样品有没有跑过普通的SDS-PAGE？可以先取10μL跑个看看有没有条带

跑过，有的，条带很清楚
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用心做事
3楼2015-05-11 13:00:09
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haze12344

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by ZRFZYY at 2015-05-11 13:00:09
跑过，有的，条带很清楚...

那你做的时候电压能上到8000v么？
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生物你好
4楼2015-05-11 15:19:43
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ZRFZYY

银虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by haze12344 at 2015-05-11 15:19:43
那你做的时候电压能上到8000v么？...

可以的
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用心做事
5楼2015-05-12 10:31:37
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haze12344

银虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by ZRFZYY at 2015-05-12 10:31:37
可以的...

那就比较奇怪，看上去聚焦没有什么问题为什么没有点？难道你银染固定没做好？
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生物你好
6楼2015-05-12 10:47:55
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ZRFZYY

银虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by haze12344 at 2015-05-12 10:47:55
那就比较奇怪，看上去聚焦没有什么问题为什么没有点？难道你银染固定没做好？...

固定液：400ml乙醇+100ml冰醋酸，定容至1000ml。过夜固定。我问过GE工程师，他说要么是水化不好，要么是第二相蛋白未进入SDS-PAGE，但我觉得我是按要求做的啊，怎么会出现这两种可能
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用心做事
7楼2015-05-12 13:31:19
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haze12344

银虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by ZRFZYY at 2015-05-12 13:31:19
固定液：400ml乙醇+100ml冰醋酸，定容至1000ml。过夜固定。我问过GE工程师，他说要么是水化不好，要么是第二相蛋白未进入SDS-PAGE，但我觉得我是按要求做的啊，怎么会出现这两种可能...

固定液的配方看上去没有问题，但是水化不好也不至于一个点都没有吧，最多点少一点。可以了解下水化液配方和蛋白处理方法么
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生物你好
8楼2015-05-13 07:53:02
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ZRFZYY

银虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by haze12344 at 2015-05-13 07:53:02
固定液的配方看上去没有问题，但是水化不好也不至于一个点都没有吧，最多点少一点。可以了解下水化液配方和蛋白处理方法么...

裂解液、水化液均按照GE公司操作手册配制，水化液配方：尿素 2.1g ，硫脲 0.76g CHAPS 0.1g， DTT14mg，IPG Buffer 25ul, 1%溴酚蓝储液 10ul,至5ml。分装1ml后-20℃冻存。
DTT,IPG Buffer及溴酚蓝为使用前新鲜加入。
蛋白是血清总蛋白，裂解后离心，取上清定量，确定水化体系
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用心做事
9楼2015-05-13 10:32:41
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haze12344

银虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by ZRFZYY at 2015-05-13 10:32:41
裂解液、水化液均按照GE公司操作手册配制，水化液配方：尿素 2.1g ，硫脲 0.76g CHAPS 0.1g， DTT14mg，IPG Buffer 25ul, 1%溴酚蓝储液 10ul,至5ml。分装1ml后-20℃冻存。
DTT,IPG Buffer及溴酚蓝为使用前新鲜加入 ...

看着都是没有问题的啊，水化体系又在常温孵育吗？还有就是加了水化液的样品跑过普通SDS-PAGE没
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生物你好
10楼2015-05-14 07:56:02
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