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静待天享

金虫 (小有名气)

[求助] ELISA实验相关问题 已有6人参与

操作步骤:
(1)包被一抗(包被液:PH9.5碳酸盐缓冲液,抗体VEGF(1:1000),4℃过夜)
(2)PBS-T20洗三次
(3)10%小牛血清PBS溶液,室温下封闭2h
(4)PBS-T20洗三次
(5)加入样品,室温下孵育2h
  (6)PBS-T20洗五次
(7)二抗(10%小牛血清PBS溶液中加入兔的抗体按照1:2000)
(8)PBS-T20洗七次
(9)加入底物反应液,黑暗下半个小时
(10)加入中止液,测量
以上是我的操作步骤,结果无论是标准品还是样品值都差不多,没有梯度,而且加入底物反应液后溶液很快就变成蓝色,也没有梯度,加入中止液变成黄色,肉眼看都是一样大的,不知道问题出现在哪里????求大神帮忙解决!
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lairena

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
加零浓度样本(样稀或者纯水)试试,或者在板上不加样本直接加酶标二抗试试,若也显色而且一样深的话,那可能是封闭不好。
http://www.qinms.com
3楼2015-01-30 09:18:15
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董博士

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
可能是样品浓度过高,建议梯度稀释后重新进行实验
医学&统计学
2楼2015-01-29 23:15:40
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feiyue122

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
楼主你用的是双抗夹心法吧,方便把数据列出来吗,这样方便看出是你的包被浓度过,还是什么问题
另外还有可能用的封闭液中小牛血清有可能会与二抗产生交叉反应的
4楼2015-01-30 09:18:21
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普通回帖

静待天享

金虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by feiyue122 at 2015-01-30 09:18:21
楼主你用的是双抗夹心法吧,方便把数据列出来吗,这样方便看出是你的包被浓度过,还是什么问题
另外还有可能用的封闭液中小牛血清有可能会与二抗产生交叉反应的

3.0498        2.3973        1.7161        2.0521        2.1788        2.2616
3.0505        2.0326        2.2802        2.0995        2.1212        2.0881
2.8965        2.6971        1.9360        2.0162        2.2177        2.2882
3.1341        2.1370        2.0572        2.1376        2.1157        2.1072
2.7908        2.3040        1.7561        1.8150        2.0982        1.7051
2.8766        2.1876        1.9752        2.0478        1.9026        1.9232
2.8291        2.4246        2.2508        2.1376        2.1307        2.0451
3.1948        2.7461        2.4154        2.1896        2.5620        2.4389
横着三个是重复孔,竖着前七个是标准品,后面九个是样品,肿瘤血清
5楼2015-01-31 09:00:49
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feiyue122

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

根据你的描述,好像,你的数据比较乱,你能把你标准品的浓度和你的OD值相对应起来吗?
6楼2015-02-02 11:54:22
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寂静之林

银虫 (小有名气)

楼主解决问题没有?
7楼2015-02-28 12:15:07
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amywang9761

木虫 (小有名气)

楼主,方便说出你的一抗和二抗分别是哪个宿主的吗?你包被的一抗,没有封闭掉未结合完的位点,如果可以和加入的二抗反应的话,就可能出现你说的结果
8楼2015-03-02 09:14:37
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yy122465518

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

看OD都这么高,可能是包被量过高导致,或者封闭不完全,建议将做下空白的样本,或者做下包被梯度,继续降低包被量。
9楼2015-03-03 11:41:59
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静待天享

金虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by amywang9761 at 2015-03-02 09:14:37
楼主,方便说出你的一抗和二抗分别是哪个宿主的吗?你包被的一抗,没有封闭掉未结合完的位点,如果可以和加入的二抗反应的话,就可能出现你说的结果

一抗、二抗用的都是WB所用的抗体,正常做WB实验结果的数据都非常好的。
10楼2015-03-16 16:10:13
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