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yaowang1991

铁虫 (小有名气)

[求助] 关于ELISA实验

各位大神
    小弟是做有机合成的，对ELISA一窍不通。看到文献上有人做合成寡糖对Dectin-1的ELISA实验，就也想试一下。他用的是Fc-tagged Dectin-1，是自己制备的，我们完全不会蛋白的重组基因表达技术，因此问他们详情，他们说可以买商品化的His-tagged Dectin-1(R&D Co.)。有一样的效果。
    理论上讲Fc标记与His标记的都可以，但请问真的是一样的么？ 我直接使用这种做实验不会不被承认吧？
    还有，我经常看见生物学的文章里要用蛋白都自己去表达，那请问向什么蛋白基因，重组质粒什么的都是买的么？工作量是不是太大了？
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1楼2013-04-06 10:17:13
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myprayer

专家顾问 (著名写手)

优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+5, MolEPI+1, good！ 2013-04-06 20:18:35
ELISA是一种免疫测定。免疫测定（immunoassay，IA）是应用免疫学技术测定标本的方法。在临床检验中主要通过抗原抗体反应检测体液中的抗体或抗原性物质。
1.1　抗原
　　抗原是能在机体中引起特异性免疫应答的物质。抗原进入机体后，可刺激机体产生抗体和引起细胞免疫。在免疫测定中，抗原是指能与抗体结合的物质。能在机体中引起抗体产生的抗原多为分子量大于5000的蛋白质。小分子化合物在与大分子蛋白质结合后能引起机体产生特异性抗体的，称为半抗原（hapten）。例如某些激素、药物等。抗原的反应性取决于抗原决定簇（antigenic determinant），或称为表位（epitope）。一个抗原分子可带有不同的决定簇。

1.2　抗体

1.2.1　抗体的结构
　　抗体是能与抗原特异性结合的免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)。Ig分五类，即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。与免疫测定有关的Ig主要为IgG和IgM。Ig由两个轻链（L）和两个重链（H）的单体组成。Ig的轻链是相同的，有κ（kappa）和λ（Lambda）两种型别。五类Ig的重链结构不同，这决定了它们的抗原性也不同。IgG和IgM的重链分别称为γ（gamma）链和μ（mu）链。IgG的结构见图。


① 木瓜酶裂解部位 ② 胃蛋白酶裂解部位



　　重链和轻链的N端的氨基酸排列顺序因各种抗体而异，称为可变区，分别用VH和VL表示。两者构成抗体的抗原结合部位，只与相应的抗原决定簇匹配，发生特异性结合（见图），是抗体专一性结合抗原的结构基础。

　　IgG可被木瓜蛋白酶分解为三个区段，其中两个相同的区段称抗原结合片段（Fab）。每个Fab都保存结合抗原的能力，但只有一个抗原结合位点，是单价的，与抗原结合后不出现凝集或沉淀。另一区段称Fc段，无抗体活性，但具有IgG特有
的抗原性。
　　IgG可被胃蛋白酶分解为两个片段，一个Fab双体，称F（ab'）2，能和两个相同的抗原结合；另一片段类似Fc，随后被分解成小分子多肽，无生物活性。
　　IgM是由五个单体组成的五聚体，含10个重链和10个轻链，具有10个抗原结合价，由于空间位置的影响，只表现为五个抗原结合价。IgM分子量约为900000，IgG分子量约为150000。
　　机体被微生物感染后，先产生IgM抗体，然后产生IgG抗体。经过一段时间，IgM抗体量逐渐减少而消失，而IgG抗体可长期存在，在疾病痊愈后可持续数年之久。

IgM抗体一般为保护性抗体，具有免疫性。因此IgM抗体的测定，对某些传染病如甲型肝炎有较高的临床诊断价值。
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3楼2013-04-06 12:36:37
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无为书生

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 鼓励应助，分子生物版块，期待你的精彩。 2013-04-06 12:25:37
FC是抗体的一个片段，His是六个组氨酸小肽，都是用来后续的免疫反应的，对你要检测的亲和反应没有影响。
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2楼2013-04-06 10:27:47
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花花贝

金虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你是不是想知道自己合成的寡糖能不能结合Dectin-1？
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4楼2013-04-06 13:17:55
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addyjin

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+3, 鼓励积极发帖帮助解答问题。 2013-04-06 20:18:44
yaowang1991: 金币+5, ★★★★★最佳答案 2013-04-10 14:12:28
Fc和His是表达后蛋白的纯化标记，只要是Dectin－1的序列能够确认是一致的，在ELISA中就会认可是相同的抗原，需要注意的是两个标记的蛋白分子量是不同的，在包被的时候要重新用方阵滴定法确定最佳包被浓度，不要直接引用人家的数据。
第二个问题，如果实验室没有相关的经验和设备就不要尝试自己表达了，买商品化的。
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5楼2013-04-06 16:50:05
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