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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 抗体/Elisa » 求助大家Elisa实验问题~
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sandydcy

新虫 (初入文坛)

[求助] 求助大家Elisa实验问题~ 已有3人参与

我在进行Elisa实验的初步摸索阶段，以前从来没有接触过相关实验，也没有很系统的学习过
希望各位大神们能帮帮忙！先谢过~~~

前言：1.我使用的是双抗夹心法，由于没有两个不同位点的单抗，故选择的是一个单抗一个多抗；
         2.同时没有自己制作酶标抗体，而是采用  抗体（兔源）-抗原-抗体（鼠源）-酶标羊抗鼠   来检测；
         3.检测过程中，先用已知浓度的标准纯抗原来制作曲线，用Logistic曲线拟合2（四参数）算法拟合曲线，R方都在0.999以上，我认识的一个之前做过抗体的人说结果很好（我不太懂）；
         4.抗原为细菌中表达的蛋白，需要检测的是转到植物中表达的该抗原；

现遇到的问题如下：
         1. 我用纯抗原来做曲线是一个Logistic曲线拟合2（四参数）的曲线，不是直线，需要用ElisaCalc这个软件来计算，这样的结果对么？
         2. 用纯抗原做好曲线后，检测植物蛋白检测不出来（已用商品化试剂盒测试确定提取物中含有转入的蛋白）检测抗原蛋白却能检测出来（平行操作）是为什么呢？正反包被都测试过（即包被多抗+抗原+单抗+抗单抗酶标二抗；包被单抗+抗原+多抗+抗多抗酶标二抗），抗原可以检测出来，含抗原的植物提取物却检不出来；直接包被植物提取物+单抗/多抗+相应酶标二抗检测，结果很怪异，阴阳性全部一样深。。。（整个人都不好了。。。）
         PS：木有条件购买其他抗体，只有一个多抗和一个单抗，单独验证过单抗、多抗均可以与抗原反应

请教大神们这个怎么解~小女子真的想不出来了~跪谢！！！
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1楼 2015-01-27 13:40:28
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lairena

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
sandydcy: 金币+5, ★有帮助 2015-01-29 09:14:32
你可尝试把标准抗原加到植物提取物看能不能检测出来，要是可以检测出来的话，那么标准抗原和植物蛋白可能不是同种东西，至少可以说植物蛋白上面没有你那个单抗所需要结合的表位，而商品化的试剂盒所使用的原料和你的是不一样的，可能针对的位点是不一样的。
你是仅仅想定量还是为了做试剂盒，若仅仅是定量，不如直接用上商品化的东西。
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3楼2015-01-27 16:08:03
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sandydcy

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by qwbio123 at 2015-01-28 11:14:25
我觉得很有可能植物提取物中的蛋白的抗体识别位点被修饰了，导致抗体无法识别抗原，如已酰化，磷酸化等。有个疑问，您的植物提取物中的蛋白是变性的还是天然形式的！
同时推荐你个北京启维益成科技有限公司的学习贴 ...

我只是简单提取，就是将植物叶片磨碎PBS缓冲，直接静置取上清检测的~
谢谢啦
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9楼2015-01-28 14:04:35
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普通回帖

kzwing

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1.直接包被植物提取物+单抗/多抗+相应酶标二抗检测 ? ELISA 有这么做的吗？
2.既然已用商品化试剂盒测试确定提取物中含有转入的蛋白 ，为什么还要ELISA测定你要定量吗？
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2楼2015-01-27 15:34:51
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sandydcy

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by kzwing at 2015-01-27 15:34:51
1.直接包被植物提取物+单抗/多抗+相应酶标二抗检测 ? ELISA 有这么做的吗？
2.既然已用商品化试剂盒测试确定提取物中含有转入的蛋白 ，为什么还要ELISA测定你要定量吗？

1.我是想试试我的抗体是不是可以和植物提取物中的抗原反应~而且手中只有酶标二抗，没有其他的酶标抗体，所以就这么做了，我也不知道可不可以这么做呀，可是我无法定量植物提取物中的抗原浓度，所以估计着包被的，结果很诡异~~可能真的不能这么做
2.因为我就是要做这个抗原Elisa检测的改进呀~不能一直买商品化的试剂盒呀，特别特别贵~
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4楼2015-01-27 16:40:53
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sandydcy

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by lairena at 2015-01-27 16:08:03
你可尝试把标准抗原加到植物提取物看能不能检测出来，要是可以检测出来的话，那么标准抗原和植物蛋白可能不是同种东西，至少可以说植物蛋白上面没有你那个单抗所需要结合的表位，而商品化的试剂盒所使用的原料和你的 ...

我也做了将抗原加到提取物中的实验，发现加了抗原的提取物与只加抗原的数值差不多，略小，但是可以忽略不计了，不加抗原的提取物和阴性数值差不多，这就能证明我的标准抗原和植物提取物中的蛋白不同了么？可是老板告诉我是一个东西呀~~~
我是要做这个检测的改进，结果现在检测都做不出来，，，，，
只是恰好有别人用剩的商品化试剂盒做了一下对照试验~
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5楼2015-01-27 16:46:15
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lairena

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by sandydcy at 2015-01-27 16:46:15
我也做了将抗原加到提取物中的实验，发现加了抗原的提取物与只加抗原的数值差不多，略小，但是可以忽略不计了，不加抗原的提取物和阴性数值差不多，这就能证明我的标准抗原和植物提取物中的蛋白不同了么？可是老板 ...

不一定是不同，可能是天然的东西和纯化的东西有点差异，比如结合有其他的蛋白或其他物质，刚好把你抗体结合的位点封闭了，我做诊断试剂的，血液里的有些抗原常常就和其他的蛋白例如白蛋白，血红蛋白等结合，说不定换个抗体就OK了。
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http://www.qinms.com
6楼2015-01-28 09:06:34
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qwbio123

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
sandydcy: 金币+5, ★有帮助 2015-01-29 09:14:08
我觉得很有可能植物提取物中的蛋白的抗体识别位点被修饰了，导致抗体无法识别抗原，如已酰化，磷酸化等。有个疑问，您的植物提取物中的蛋白是变性的还是天然形式的！
同时推荐你个北京启维益成科技有限公司的学习贴http://www.bioconsumable.com/cn/tech/2011/12-23/tech_22884582.htm
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7楼2015-01-28 11:14:25
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sandydcy

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by lairena at 2015-01-28 09:06:34
不一定是不同，可能是天然的东西和纯化的东西有点差异，比如结合有其他的蛋白或其他物质，刚好把你抗体结合的位点封闭了，我做诊断试剂的，血液里的有些抗原常常就和其他的蛋白例如白蛋白，血红蛋白等结合，说不定 ...

换抗体的费用很高，暂时没有其他的可能了么？
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8楼2015-01-28 14:03:25
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feiyue122

金虫 (正式写手)
很有可能是你的植物提取物中的蛋白抗体的结合位点变点了，导致你的抗体识别位点不能识别，所以检测不出来了
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10楼2015-01-29 11:15:20
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