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静待天享

金虫 (小有名气)

[求助] ELISA实验相关问题已有6人参与

操作步骤:
(1)包被一抗(包被液:PH9.5碳酸盐缓冲液,抗体VEGF(1:1000),4℃过夜)
(2)PBS-T20洗三次
(3)10%小牛血清PBS溶液,室温下封闭2h
(4)PBS-T20洗三次
(5)加入样品,室温下孵育2h
  (6)PBS-T20洗五次
(7)二抗(10%小牛血清PBS溶液中加入兔的抗体按照1:2000)
(8)PBS-T20洗七次
(9)加入底物反应液,黑暗下半个小时
(10)加入中止液,测量
以上是我的操作步骤,结果无论是标准品还是样品值都差不多,没有梯度,而且加入底物反应液后溶液很快就变成蓝色,也没有梯度,加入中止液变成黄色,肉眼看都是一样大的,不知道问题出现在哪里????求大神帮忙解决!
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