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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 药学 » 药代动力学 » 标准血浆的处理
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桑枝

新虫 (初入文坛)

[求助] 标准血浆的处理已有1人参与

最近在做药动学，有几个疑问向请教一下大家。
一、在做标准曲线时两种方法哪种对啊？
我取的是100μL空白血浆，加内标10μL，两倍体积甲醇沉淀蛋白，涡旋（涡旋时间有必要考察吗？）后，12000R/min离心10min，取上清液进样，进样量5μL。
1.直接加10μL不同浓度的对照品溶液在血浆里面配成一系列浓度的标准血浆。这个浓度时按照100μL作为体积来看，还是还应算成110μL或者血浆加成90μL。那么在我后面给药后取血浆的样品中没有加这10μL的对照品，那么是不是应该在血浆中加入10μL甲醇，10μL内标后再两倍体积甲醇沉淀蛋白，来和方法学考察中提取的方法保持一致？
2.将对照品氮气吹干后加入100μL空白血浆，10μL内标物，两倍体积甲醇沉淀蛋白，涡旋后，12000R/min离心10min，取上清液进样，进样量5μL。

二、从经验上来判断取上清液进样的回收率高还是上清液吹干复溶回收率高？做提取回收率的时候是直接与同浓度对照品溶液峰面积比来算还是空白血浆处理好以后再加同浓度对照品溶液复溶后峰面积比来计算呢？

三、标准曲线是要取六个来源不同的空白血浆来做平行还是都用一只兔子的空白血浆就行？那么计算标准曲线时是拿六个点的平均数来算吗？

四、以后的样品测定中每批的随行标准曲线是要每天都重做吗？可以保留之前做的反复进样来做标曲吗？

问题比较多，拜托大家了~
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1楼2015-01-28 16:49:59
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rosegarden

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
桑枝: 金币+12, ★★★很有帮助 2015-01-31 10:35:03
一，标准曲线的做法，很二种比较规范。但操作复杂，可简化为加标液后，加空白血，再加内标，加沉淀剂甲醇的时候减去标液体积10ul,加190ul。
二，回收率肯定是直接蛋白沉淀的比较高。计算回收率的对照品是空白血浆处理后，再加入标准溶液。
三，如果用液质做，要考察不同来源基质的基质效应。做标曲的时候，可以将不同来源的基质混合即可。做一条标曲就可以。
四，正规做法是每个分析批标曲新鲜配置。
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坚持
2楼2015-01-28 19:03:20
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桑枝

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by rosegarden at 2015-01-28 19:03:20
一，标准曲线的做法，很二种比较规范。但操作复杂，可简化为加标液后，加空白血，再加内标，加沉淀剂甲醇的时候减去标液体积10ul,加190ul。
二，回收率肯定是直接蛋白沉淀的比较高。计算回收率的对照品是空白血浆处 ...

你好，那请问沉淀蛋白时的两倍量体积甲醇不用考虑内标液的体积吗？
假如是处理的样品，100μL血浆加10μL内标，我以前都是加的220μL甲醇来沉淀蛋白。还是说我一直做错了，只要血浆的两倍就行？
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3楼2015-01-28 20:15:41
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rosegarden

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 桑枝 at 2015-01-28 20:15:41
你好，那请问沉淀蛋白时的两倍量体积甲醇不用考虑内标液的体积吗？
假如是处理的样品，100μL血浆加10μL内标，我以前都是加的220μL甲醇来沉淀蛋白。还是说我一直做错了，只要血浆的两倍就行？...

这个甲醇沉淀的体积是你自己决定的，你想用220ul也可以，但是，你表述的1:2沉淀，肯定是相对于血浆来说的，所以是200ul。只要是你做标准曲线的时候平行就行了，对定量没有影响。
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坚持
4楼2015-01-28 20:27:08
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rosegarden

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

一般我习惯的做法是甲醇1:3沉淀，可能可以获得更好的提取回收率。
兼顾灵敏度的情况下，你可以参考一下
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坚持
5楼2015-01-28 20:30:02
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桑枝

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by rosegarden at 2015-01-28 20:30:02
一般我习惯的做法是甲醇1:3沉淀，可能可以获得更好的提取回收率。
兼顾灵敏度的情况下，你可以参考一下

哦哦，好的~谢谢啦
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6楼2015-01-31 10:34:27
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岳苏2011

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by rosegarden at 2015-01-28 19:03:20
一，标准曲线的做法，很二种比较规范。但操作复杂，可简化为加标液后，加空白血，再加内标，加沉淀剂甲醇的时候减去标液体积10ul,加190ul。
二，回收率肯定是直接蛋白沉淀的比较高。计算回收率的对照品是空白血浆处 ...

请问，如果只是进液相检测定量，还用做基质效应吗？
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7楼2015-03-07 14:47:30
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rosegarden

金虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 岳苏2011 at 2015-03-07 14:47:30
请问，如果只是进液相检测定量，还用做基质效应吗？...

严格来说是要做的，就算你用的是UV检测器，在进行生物样品分析的时候还是要考虑基质的影响。
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岳苏2011
坚持
8楼2015-03-07 19:27:40
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岳苏2011

铁杆木虫 (著名写手)
送红花一朵
引用回帖:
8楼: Originally posted by rosegarden at 2015-03-07 19:27:40
严格来说是要做的，就算你用的是UV检测器，在进行生物样品分析的时候还是要考虑基质的影响。...

谢谢
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9楼2015-03-07 21:09:56
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一定一定

新虫 (小有名气)
每天都要做一个标曲的， 可以用一只兔子的空白血浆 影响不大，，，标曲配制我们都是20μL+180ul血浆+30μL内标，涡旋30s，然后+370μL乙腈  涡旋3min，，之后在离心10min，
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10楼2015-05-13 09:24:57
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