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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 药学 » 药物分析 » 求教血浆样品进HPLC前处理过程
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饺子813

铜虫 (小有名气)

[求助] 求教血浆样品进HPLC前处理过程

用HPLC测血浆药物浓度，预计待测浓度在100ng——4000ng之间。
之前用的血浆处理方法是这样的：
取100ul血浆样品，加50ul内标，850ul甲醇————混匀1min——离心10min————取上清————过滤进样（每次进样20ul）。【我用的流动相是乙腈和水，标准样品是用甲醇配制的。】
结果出来高中低三个浓度的回收率呈递减趋势，相差很大，低浓度大概有50%~60%。然后看文献上的血样处理方式好像是有这样的：
取400ul血浆样品，加20ul内标，加5ml混合萃取剂————混匀、离心各10min——取上清氮气吹干——100ul流动相复溶进样。
我的问题是：
1、氮气吹干再复溶的目的是为了浓缩吗？这一步对提高回收率有什么作用吗？用上述文献中方法处理之后，是不是相当于将原来400ul里的药物浓缩到最后100ul中（理想中），就是浓度变成了4倍吗？
2、我取的血浆样品只有100ul，而且最后用100ul流动相复溶的话实在太少了，我用的进样瓶是1ml的，100ul刚盖过瓶底，针头吸不到样品。我想在原来用甲醇萃取一遍之后，再加一些甲醇混匀提取一次，这样会不会回收率能高些？
3、请教各位大神有没有更好、更简单的处理方法？我做的血样大概有400多个。。。。。。
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1楼2013-04-01 10:34:01
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weantony

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
建议你进样使用内插管，这样更小的复溶体积都可以，价格不贵的，几十块钱一包一两百个，塑料的；你的定量下限是多少阿
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饺子813
6楼2013-04-01 14:44:58
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lmxc_sx

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
氮气吹干的目的是为了去除有机相中的杂质，你复溶的时候还是可以加400ul，选取合适进样量就可以了，但是稀释倍数和定量下线一定要搞清楚。
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2楼2013-04-01 11:21:56
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饺子813

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lmxc_sx at 2013-04-01 11:21:56
氮气吹干的目的是为了去除有机相中的杂质，你复溶的时候还是可以加400ul，选取合适进样量就可以了，但是稀释倍数和定量下线一定要搞清楚。

稀释倍数这个问题我还真是没搞明白。。。
假设我原先的血浆样品浓度是400ng/ml,取400ul样品，加50ul内标，加5ml萃取剂，混匀离心×××××，最后用400ul流动相复溶，那么最终样品被稀释了几倍(假定药物没有损失)？我觉得浓度不变啊......开始400，最后还是400.....这样理解对不对？
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3楼2013-04-01 12:21:01
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xxaijwd

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
饺子813: 金币+20, ★★★★★最佳答案, 非常感谢你的帮助！ 2013-04-08 09:22:37
引用回帖:
3楼: Originally posted by 饺子813 at 2013-04-01 12:21:01
稀释倍数这个问题我还真是没搞明白。。。
假设我原先的血浆样品浓度是400ng/ml,取400ul样品，加50ul内标，加5ml萃取剂，混匀离心×××××，最后用400ul流动相复溶，那么最终样品被稀释了几倍(假定药物没有损失) ...

氮气吹干一方面是为了除去有机相（萃取时一般都是二氯甲烷、乙醚等有机相，一般不会直接把这些进柱子），另外，如果复溶体积和开始时血浆体积不同，也能起到浓缩的作用，比如400微升血浆，最后复溶到100微升，就是浓缩了4倍，更利于样品的检测，但是你用400微升复溶就没有浓缩倍数了。如果讲简单的样品前处理的话，对于常规方法没有什么好办法的，甲醇/乙腈沉淀蛋白样品处理时间已经很短了，但是样品相对液液萃取脏一些，对柱子不好。
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4楼2013-04-01 12:29:31
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xxaijwd

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

此外，如果你的定量限不够的话，可以适当提高进样量，比如你进40微升，就相当于提高一倍了啊。
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饺子813
5楼2013-04-01 12:30:46
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饺子813

铜虫 (小有名气)
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引用回帖:
5楼: Originally posted by xxaijwd at 2013-04-01 12:30:46
此外，如果你的定量限不够的话，可以适当提高进样量，比如你进40微升，就相当于提高一倍了啊。

提高进样量   嗯 是个好办法  多谢指教啦！
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7楼2013-04-01 15:03:18
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饺子813

铜虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
6楼: Originally posted by weantony at 2013-04-01 14:44:58
建议你进样使用内插管，这样更小的复溶体积都可以，价格不贵的，几十块钱一包一两百个，塑料的；你的定量下限是多少阿

定量下限什么的我没有具体测过，只是大体比较了一下S/N=10的峰高和线性范围的下限，我觉得应该能测出来......
能否请教下您内插管从哪里买？发个链接可以吗？谢谢啦！
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8楼2013-04-01 15:06:10
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weantony

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 饺子813 at 2013-04-01 15:06:10
定量下限什么的我没有具体测过，只是大体比较了一下S/N=10的峰高和线性范围的下限，我觉得应该能测出来......
能否请教下您内插管从哪里买？发个链接可以吗？谢谢啦！...

可能是你的提取溶剂选取的不好 换换别的提取溶剂试试看吧 你直接找你们实验室买塑料离心管的耗材商就行了 他们肯定有的 塑料的不一定有 如果实在没有你可以买国产塑料的pcr管 200ul的那种 把盖子剪掉就可以用了 大小正合适 你可以让耗材商给你送几个样品试试看
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9楼2013-04-01 15:41:45
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星星的眼睛

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

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3楼: Originally posted by 饺子813 at 2013-04-01 12:21:01
稀释倍数这个问题我还真是没搞明白。。。
假设我原先的血浆样品浓度是400ng/ml,取400ul样品，加50ul内标，加5ml萃取剂，混匀离心×××××，最后用400ul流动相复溶，那么最终样品被稀释了几倍(假定药物没有损失) ...

你这个理解是对的。你提到的两种方法都可以用来处理血样，处理血样的目的就是除去蛋白，并且保证药物浓度可定量；你的回收率较低的话，你试试加大混合的时间和强度，怀疑你药物可能没有完全溶出来；还有就是你看看你你的回收率计算方法是否有错误
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10楼2013-04-02 10:25:36
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