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陈彦利

铁虫 (小有名气)

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[求助] 西红柿果肉RNA提取，降解严重已有10人参与

第一次提RNA，最近提西红柿果肉RNA，降解很严重（见图）。西红柿果肉在液氮中不好研磨，所以我直接在裂解液里研磨的，大概2~3g西红柿加3 mTRNzol试剂研磨（样品量是不是大了？），用的是天根的TRNzol 总 RNA 提取试剂盒，电泳用1%琼脂糖电泳，90V，电泳20min。上样时，好几次都是样品都飘起来，沉不下去，是不是乙醇挥发不彻底？请老师们同学们帮忙分析一下。提了很多次都这样，快崩溃了...求过来人指导！

20141215_095059.jpg

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1楼 2014-12-15 15:51:33

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liyuecoool

新虫 (初入文坛)

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【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1

1.你的样品加入太多了，一般试剂盒只需要50mg-100mg样品即可，太多的话内源性的RNase太多，Trizol里的抑制剂抑制效果不完全。
2.你的电泳时间太久了，难免会分解严重。再次重复下试试，将电泳缓冲液TAE重新换制，电压调高(150V)，时间缩短（10-15min），只要能区分去三条带即可。
3.确保提取过程中操作严格，保持空气不要流动，离心机全程4℃。
4.你说的上样时会飘起来？是不是没有用Loading Buffer染色？不会是酒精没挥发完全，可以测量纯度（OD260/230）来观察，有酒精残留时候会有乱峰，参考乙醇的峰型。
希望对你有用，祝你实验顺利。

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陈彦利

18楼2014-12-16 16:28:36

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chriscda

木虫 (小有名气)

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【答案】应助回帖

一般性地，建议你注意这些事项：1. TRIzol一般需要达到样品的10倍体积；2. 全程使用RNase-free的耗材、试剂（包括水）和新鲜的电泳缓冲液； 3. 在5-10分钟内完成电泳。
不过，具体到你的实验，我觉得不像是发生严重降解，或者说我没觉得有降解。可能是RNA载样过多，染料（可能你用的EB，其他的也差不多）被小分子量的RNA吸附得差不多了，大分子量的18S和28S就会变暗。发生降解是你会观察到各个条带分子量都有变小，跑出弥散的结果。

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35楼2014-12-18 17:21:03

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