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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 大肠杆菌RNA提取求大虾帮忙
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shalimar1989

新虫 (初入文坛)

[求助] 大肠杆菌RNA提取求大虾帮忙 已有2人参与

本人要提取大肠杆菌的RNA做荧光定量PCR，本以为大肠的很好提，没想到提了1个多月也没有好结果，求指导！！！拜谢啊
我的问题如下：
1 菌液量如何控制，有报道说要10 +7数量级的细胞，可是1od菌浓度就已经10 +8数量级了吧？难道1OD的菌液就要稀释10倍？我稀释以后菌量很少
   根本提不出来，应该怎么去菌液呢？麻烦大虾指导清楚点，一般OD多少菌液取多少毫升，加多少Trizol？
2 加Trizol要反复吹打吗？静置多久合适？
3 加异丙醇后需要静置吗？多久合适？其实我没静置时也有提出来过，见图，只是降解严重也有DNA污染，会不会不静置沉淀不充分呢？
4 我发现用试管的菌液提取相对容易，而我转摇瓶发酵后就很难提取出来RNA了，取样也处于生长期的菌体，这个是什么问题呢？？？

图中是我提的试管培养12小时的菌液，没稀释，还能出现条带，发酵的菌液根本提不出来，一条带也没有，到底怎么回事呢。。。
大肠杆菌RNA提取求大虾帮忙
11.21.jpg
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1楼 2014-01-05 10:15:03
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eagles123

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
laozuzunzhe: 金币+1, 鼓励应助！ 2014-01-05 16:16:15
最好还是用kit提吧， 所有器具都用RNase Zap 擦洗避免RNAJ降解， 然后用RNase free 的 DNase 降解DNA
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2楼2014-01-05 11:04:12
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shalimar1989

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by eagles123 at 2014-01-05 11:04:12
最好还是用kit提吧， 所有器具都用RNase Zap 擦洗避免RNAJ降解， 然后用RNase free 的 DNase 降解DNA

已经买了TRIZOL了，如果能不换就不太想买试剂盒了。。。谢谢
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3楼2014-01-05 12:04:30
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yangpanfei

禁虫 (正式写手)
感谢参与，应助指数 +1
本帖内容被屏蔽
4楼2014-01-07 11:52:53
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shalimar1989

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by yangpanfei at 2014-01-07 11:52:53
加Trizol后涡旋震荡30s,冰上放置15min；
加异丙醇后冰上放置0.5h;

请问你试过吗？放置半小时不是都降解吗？快速提取不是最重要的吗？有人说省去放置的时间，要快提才行，放置半小时。。。请问大侠有这样提过吗？效果好？
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5楼2014-01-07 13:09:19
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yangpanfei

禁虫 (正式写手)
本帖内容被屏蔽
6楼2014-01-07 15:04:52
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shalimar1989

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by yangpanfei at 2014-01-07 15:04:52
我之前提过酵母的RNA，不过刚才说错了，加异丙醇后-20度放置半小时，这点时间是不能省的...

你的意思是要保证沉淀充分是吗？菌量有控制吗？
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7楼2014-01-07 21:43:04
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irufver

新虫 (初入文坛)
楼主想问一下你提出来没？我正准备提，也是想从发酵液中提RNA，但是我在纠结何时取样比较好。
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8楼2015-05-06 19:06:21
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mabinbin0209

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by irufver at 2015-05-06 19:06:21
楼主想问一下你提出来没？我正准备提，也是想从发酵液中提RNA，但是我在纠结何时取样比较好。

你好，我最近也想提一下大肠的RNA，但是每次都降解，，请问你提出来了吗，可否指点一二
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9楼2015-12-02 20:22:46
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mabinbin0209

新虫 (初入文坛)
请问楼主，是否提出来未降解的RNA，求指点，本人最近一直在提，但是总是遇到跟你一样的问题，降解非常明显
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10楼2015-12-02 20:25:00
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