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lianchen1218

金虫 (正式写手)

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[求助] western blot小分子检测不出已有3人参与

最近在做细胞色素c cytochrome c的western blot,可是总是检测不出来，现在是和一个月之前同样的细胞系，同样的处理，同样的操作步骤，就是所用的东西都一样，可是就是检测不出来，之前都可以检测出来。
我的电泳条件是
15%的胶
60-70V浓缩胶，分离胶就100-120V，蛋白没有跑出来
转膜，4度
120V，90min; 110v,60min; 110V, 100min都试过
到丽春红染色的时候15-10KD的条带实验组就几乎没有，可是同样的一张膜上，阳性对照组在15-10KD又有明显的条带，而且上样量都一样。
缓冲液都没超过三次使用。
封闭5%牛奶，1h
二抗也是1h
显影的时候，有时候阳性对照都没有细胞色素C，但是有时候又有，不过实验组就一直没有。
我的细胞处理是
收集后离心，提取沉淀，用细胞分离液含0.01%digitonin，常温，15min，目的是分离细胞溶胶和其余的细胞器，因为cytochrome c是从线粒体释放到细胞溶胶的。
完全一样的操作，可是现在就是怎么都检测不到细胞色素c，一个月了，耽误了不少时间。请大家指导一下，可能是哪里出了问题？
拜谢了！

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原创首发：Tips for Western Blot-一些小技巧而已已经有13人回复

勇敢一点，去充实自己

1楼 2014-12-09 02:33:03

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

lianchen1218

金虫 (正式写手)

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引用回帖:

5楼: Originally posted by needle_ld at 2014-12-19 13:28:36
How do you make transfer buffer?
do you have methanol? how much?
I would recommend 20%mathanol in the transfer buffer. or, maybe you can decrease your time for transfer?

Where do you get the fir ...

Thank you for your suggestion.
First, I add 20% methanol in the transfer buffer. And I already decreased the time to 1 h, 110V. And used the new prepared primary antibody, increased loading to 40ug, still nothing.
Second, antibody are kept in fridge. Because the others can detect the cytochrome c with the same primary antibody, so I don't think it's the problem.
I also do other targets, GAPDH works well. Except cytochrome c, all the other staff work well.