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lianchen1218金虫 (正式写手)
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western blot小分子检测不出已有3人参与
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最近在做细胞色素c cytochrome c的western blot,可是总是检测不出来，现在是和一个月之前同样的细胞系，同样的处理，同样的操作步骤，就是所用的东西都一样，可是就是检测不出来，之前都可以检测出来。 我的电泳条件是 15%的胶 60-70V浓缩胶，分离胶就100-120V，蛋白没有跑出来 转膜，4度 120V，90min; 110v,60min; 110V, 100min都试过 到丽春红染色的时候15-10KD的条带实验组就几乎没有，可是同样的一张膜上，阳性对照组在15-10KD又有明显的条带，而且上样量都一样。 缓冲液都没超过三次使用。 封闭5%牛奶，1h 二抗也是1h 显影的时候，有时候阳性对照都没有细胞色素C，但是有时候又有，不过实验组就一直没有。 我的细胞处理是 收集后离心，提取沉淀，用细胞分离液含0.01%digitonin，常温，15min，目的是分离细胞溶胶和其余的细胞器，因为cytochrome c是从线粒体释放到细胞溶胶的。 完全一样的操作，可是现在就是怎么都检测不到细胞色素c，一个月了，耽误了不少时间。请大家指导一下，可能是哪里出了问题？ 拜谢了！ |
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fuyuandj86
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