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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 抗体/Elisa » OD值偏高的问题
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疯狂的bamboo

铜虫 (小有名气)

[求助] OD值偏高的问题 已有1人参与

我是通过抗原免疫后测定血清中抗体效价问题，包被抗原5ug/ml,每孔100ul；封闭；血清采用倍比稀释，1:10,1:20……1:6400，每孔100ul；二抗结合，1:5000稀释；底物结合。最后结果对照组和实验组OD值偏高，高的达到了2.3左右，对照组OD值相对低一点，但是实验组与之相比未达到显著，求高人指点下问题出在哪了？bb不多，先谢过了！
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1楼 2014-11-23 10:06:21
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回帖置顶 ( 共有1个 )

hbl215

金虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
疯狂的bamboo: 金币+15, ★★★很有帮助 2014-11-25 04:58:48
疯狂的bamboo: 金币+17, ★★★★★最佳答案, 完全解决了我的问题 我发现最主要的溶血影响了测定 换了血清之后就没问题了 另外我也把封闭时间延长了 非常感谢 2014-11-26 20:07:36
疯狂的bamboo: 回帖置顶 2014-11-26 20:08:08
可能的原因：1.封闭不够完全，一般37度两小时，一小时勉强行（空白OD值高跟显色时间长短，显色试剂灵敏度都有关系）
2.二抗浓度过高，孵育时间过长，都容易出现OD值偏高。你这里的二抗时间温度没问题，稀释度跟所购试剂有关，这个确定一下不是太高。
3.采血确认是没有溶血情况，溶血会引起假阳性。
4.以上三者都没问题了，再看阴性对照跟实验组数据，如果相近的话，那就考虑抗原的问题了，或者獭兔所处环境接触到类似你说所用免疫原的物质。
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11楼2014-11-24 21:37:53
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limichuan

金虫 (正式写手)

免疫学实验超人qq：858200882

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
疯狂的bamboo: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-11-24 09:48:06
从你空白和对照组来看，问题很大可能出在你封闭不完全。能告诉我你的封闭方法及封闭液配方吗，要是不方便可以发我站内短信。
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本公司专业从事蛋白纯化，抗体制备等免疫实验技术服务。欢迎咨询qq：858200882
5楼2014-11-24 09:03:01
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azhongwei

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 疯狂的bamboo at 2014-11-23 22:39:42
我是通过抑制素抗原免疫獭兔后测定抑制素（inhibin）抗体效价，下面是我的实验方案
1 用包被缓冲液将inhibin（当初注射用的抗原，inhibin完全重组蛋白）稀释至5ug/ml，每孔100ul，4℃过夜。次日洗涤三次，每次两分 ...

个人感觉你的空白值也太高了，不是要低于零点零几？还有就是好像有些孔测出的值不对劲，是不是实验的过程中有交叉污染没注意，因为以前我做的时候也有过这样的情况，其他的我就不知道了
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疯狂的bamboo
6楼2014-11-24 09:17:55
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普通回帖

limichuan

金虫 (正式写手)

免疫学实验超人qq：858200882

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
疯狂的bamboo: 金币+5, ★有帮助 2014-11-23 22:38:03
你把数据贴出来，给你分析。
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2楼2014-11-23 22:21:38
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疯狂的bamboo

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by limichuan at 2014-11-23 22:21:38
你把数据贴出来，给你分析。

第一行是空白对照 第二行是试验对照，下面的是实验组，麻烦帮我好好看看哈。
OD值偏高的问题
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3楼2014-11-23 22:37:41
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疯狂的bamboo

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by limichuan at 2014-11-23 22:21:38
你把数据贴出来，给你分析。

我是通过抑制素抗原免疫獭兔后测定抑制素（inhibin）抗体效价，下面是我的实验方案
1 用包被缓冲液将inhibin（当初注射用的抗原，inhibin完全重组蛋白）稀释至5ug/ml，每孔100ul，4℃过夜。次日洗涤三次，每次两分钟。
2 动物血清梯度稀释（1:10 1:100……1:1000000）后来改为（1:10,1:20……），每孔100ul，室温孵育1h，洗涤三次，同时做空白对照，阴性对照（就是我在实验中设的对照，未注射抗原）
3 加入新鲜稀释的酶标二抗（羊抗兔），1:5000稀释，100ul，室温孵育45min，洗涤
4 加入底物显色液TMB，新鲜配制，100ul每孔，室温15min
5 加2M 硫酸 200ul每孔，终止
6 elisa检测仪检测450nm处OD值
我原本是打算：比较实验组和阴性对照组的OD值确定阳性阴性的，但是测定的OD值（1）OD值普遍较高；（2）虽然同一稀释度下，实验组OD值高于对照组，但没有达到判定阳性的水平。可以确定的是：实验组中肯定有抑制素抗体，因为通过其他途径的激素变化已经确定了。是不是试验步骤 加量方面存在问题呀？？求指导
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4楼2014-11-23 22:39:42
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疯狂的bamboo

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by limichuan at 2014-11-24 09:03:01
从你空白和对照组来看，问题很大可能出在你封闭不完全。能告诉我你的封闭方法及封闭液配方吗，要是不方便可以发我站内短信。

我用的5%的脱脂奶粉封闭的，每孔200ul 能把这个问题解决了 我所有bb全给你都无所谓。
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7楼2014-11-24 09:47:54
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疯狂的bamboo

铜虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
6楼: Originally posted by azhongwei at 2014-11-24 09:17:55
个人感觉你的空白值也太高了，不是要低于零点零几？还有就是好像有些孔测出的值不对劲，是不是实验的过程中有交叉污染没注意，因为以前我做的时候也有过这样的情况，其他的我就不知道了...

交叉污染的问题应该比较小 自我感觉操作还是很规范的
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8楼2014-11-24 09:49:04
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limichuan

金虫 (正式写手)

免疫学实验超人qq：858200882

【答案】应助回帖

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★ ★ ★ ★ ★
疯狂的bamboo: 金币+5, ★有帮助 2014-11-24 14:12:01
你这样的，用PBS配点BSA去封闭下试试。四度过夜
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9楼2014-11-24 13:30:27
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疯狂的bamboo

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by limichuan at 2014-11-24 13:30:27
你这样的，用PBS配点BSA去封闭下试试。四度过夜

嗯，封闭一定要那么久吗，正常1小时够不够呢？

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10楼2014-11-24 14:11:44
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