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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】间接Elisa中，抗原浓度越高，阳性值反而越低？
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zsm0507

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】间接Elisa中，抗原浓度越高，阳性值反而越低？

本人用自己表达的抗原纯化后做间接Elisa，当包被浓度为0.5ug/ml包被100ul)，阳性值OD大概在1.2左右，阴性值在0.1以下 ，可是当我提高抗原的浓度（二抗稀释度相同的条件下），阳性值反而降低，但是阴性值是稍微升高的，重复过好几次都是这样，不知道是什么原因？有经验的前辈指点下，万分感激！！
抗原浓度    二抗稀释度 "阳性"    阴性
0.7ug/ml            2万            1.872          0.278
            4万            1.354           0.16
1.4ug/ml            2万        1.923        0.271
         4万        1.181        0.171
         6万        0.7        0.127
2.8ug/ml         2万        1.388        0.361
        4万        0.841        0.198
        6万        0.503        0.125
抗原浓度 二抗稀释度 阳性        阴性
0.5ug/ml        2万        1.225        0.054
        4万        0.807        0.034
        6万        0.56        0.028
        8万        0.326        0.032
1ug/ml        2万        1.267        0.073
        4万        0.715        0.06
        6万        0.451        0.053
        8万        0.364        0.057

[ Last edited by zsm0507 on 2010-12-22 at 10:33 ]
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1楼2010-12-22 10:18:20
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zhfb619ncu

金虫 (小有名气)
★
dhd997(金币+1):鼓励交流 2010-12-23 08:41:41
zsm0507(金币+2):谢谢您的解答 2010-12-23 11:59:16
zsm0507(金币+2): 2011-05-05 08:57:38
是不是你的操作过程的某个环节出错了？或者是你的抗原变质了呢，你的抗原是自己提取的么？
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2楼2010-12-22 12:50:58
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zsm0507

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by zhfb619ncu at 2010-12-22 12:50:58:
是不是你的操作过程的某个环节出错了？或者是你的抗原变质了呢，你的抗原是自己提取的么？

操作过程不会出错，抗原刚纯化没多久的，再说，抗原要是变质了，也是没有活性，阳性值肯定很低，现在的问题是，超过一定浓度，增加抗原的浓度，阳性OD值反而没有增加，甚至降低，不知道什么原因？
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3楼2010-12-22 16:18:28
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dianaofyezi

金虫 (正式写手)
★ ★
dhd997(金币+2):谢谢交流 2010-12-23 08:41:50
zsm0507(金币+2): 2011-05-05 08:59:57
你的数据排列不整齐，没有仔细看。但是针对的你的问题有一种解释就是抗原抗体的反应的三个过程，这个在很多书上都有讲。当蛋白过量的时候（即超过最佳结合比例），包被的抗原太多了，形成空间位阻，会干扰抗体的结合，结合的抗体少了，当然OD值就下来了。所以建立方法的时候一般都会用用方针法确定一个大致的抗原抗体浓度。
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4楼2010-12-22 17:49:08
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zsm0507

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by dianaofyezi at 2010-12-22 17:49:08:
你的数据排列不整齐，没有仔细看。但是针对的你的问题有一种解释就是抗原抗体的反应的三个过程，这个在很多书上都有讲。当蛋白过量的时候（即超过最佳结合比例），包被的抗原太多了，形成空间位阻，会干扰抗体的结 ...

首先非常感谢您的耐心解答，如果是抗原过量的话，为什么我的抗原包被浓度那么低才0.5ug/ml就可以了，当浓度甚至多于1ug/ml的时候抗原就过量了呢，我一开始也是觉得可能是抗原过量，可是，用的抗原浓度并不是很高，所以我就想是不是还有其他方面的原意呀？
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5楼2010-12-23 08:22:29
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dianaofyezi

金虫 (正式写手)
★ ★
dhd997(金币+2):鼓励热心交流 2010-12-23 08:57:49
zsm0507(金币+8):谢谢您的耐心解答和指导！ 2010-12-23 11:57:06
这个抗原过量和你的抗体浓度有关的，而不是相对你包被的浓度而言的。当然有这样现象的原因会比较多，所以需要其他实验排除下。至少首先应该要排除的是不是因为操作原因引起的
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6楼2010-12-23 08:46:31
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zsm0507

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by dianaofyezi at 2010-12-23 08:46:31:
这个抗原过量和你的抗体浓度有关的，而不是相对你包被的浓度而言的。当然有这样现象的原因会比较多，所以需要其他实验排除下。至少首先应该要排除的是不是因为操作原因引起的

那请问除了抗原包被浓度过高之外，还有什么其他原因会造成这种现象呀？
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7楼2010-12-23 15:11:37
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dianaofyezi

金虫 (正式写手)
这个有点难度，要看实际的数据决定哦，我也没有看到你其他检测数据哦。例如说增加抗体浓度，OD值会怎么变化？你做的方针结果如何？二抗浓度的改变由什么变化？等等
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8楼2010-12-23 18:16:13
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zsm0507

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by dianaofyezi at 2010-12-23 18:16:13:
这个有点难度，要看实际的数据决定哦，我也没有看到你其他检测数据哦。例如说增加抗体浓度，OD值会怎么变化？你做的方针结果如何？二抗浓度的改变由什么变化？等等

我上面写得数据上有的，二抗浓度增加OD值是升高的。
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10楼2010-12-28 09:14:01
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陶然悦

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
是不是因为浓度低出现了非特异反应，所以值比较高呢?
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11楼2014-07-06 12:44:19
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dashu-973329楼
2010-12-23 21:42   回复  
zsm0507(金币+2): 2011-05-05 08:58:28
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