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金虫 (小有名气)

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[求助] 噬菌体展示库淘选出抗体，怎么检测抗体与抗原的结合能力

实验室前辈构建出噬菌体展示库了，我和同事一起做淘选工作，已经淘选出一批抗体，经过phage-ELISA检测挑选出数值比较高的单克隆，目前我们想利用HB2151来表达抗体，然后再检测表达出来的抗体与抗原的结合能力，这里我们遇到了难题：
我们的实验是这么安排的：
1.0.002ug/ul,100ul抗原包被，4°过夜
2.洗涤，2%脱脂牛奶封闭2h
3.洗涤，加入100ul 浓度未知的HB2151的表达抗体
4.洗涤，加入的0.2ug/ml的Anti-E-tag（该抗体试剂推荐的ELISA使用浓度）
5.洗涤，加入山羊抗兔IgG (H+L)（该抗体试剂推荐的ELISA使用浓度）
6.洗涤，TMB显色
7.终止反应，测值
因为第一次做此类实验，对于很多实验原理不是很清楚，设置对照时有点迷糊，望高手不要见笑：
1.PBS,实验组在用抗原包被时本对照组直接加的PBS，之后一直封闭，在上述实验进行到加一抗时，开始同步处理；
2.PBS+随机选取的HB2151表达的抗体，和前面一样，实验组抗原包被时本对照组直接加PBS，封闭后加入任选的表达抗体，之后实验同步处理；
但是实验结果却出人意料，实验组数值都很低，反倒是对照组1（只加了PBS的）数值最大，对照组2（PBS+随机选取的HB2151表达的抗体）次之。
百思不得其解，望高手不吝赐教，如果是我们设置的对照不正确误导了我们，望给出正确的对照设计，另在实验中在加抗体与抗原结合时是否需要加入合适浓度的封闭剂防止非特异性结合？
万分感谢！！！！

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行到水穷处，坐看云起时！

1楼 2011-04-26 10:45:41

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rhy1027

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【答案】应助回帖

★ ★ ★
hflf(金币+2): 2011-04-26 15:41:10
lstt09nk(金币+3): 辛苦~~ 2011-04-26 22:30:46

从你的描述看，包板的抗原浓度是没问题的（0.5ug/ml我也常用，你的高四倍，更应该没问题了）！至于第二步你的目标展示抗体，相信你也是做了WB或者相关实验验证过才拿来这里做的。但你最好考虑定个量（例如用Biacore定量，最简单的format就是Immobilize antigen 在chip上，然后直接detect你的antibodies，analyze with biovalent model）。后面的两个抗体都是Commercial的，理论上说也不应该有问题！

另：背景太高的问题，你可以换个blocking buffer。4%-5%的牛奶，或者Protein free blocking buffer也行，还有种chemical blocking buffer，可通过调节稀释倍数来决定block的强度！37度2h。