| 查看: 2883 | 回复: 7 | ||||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||||
[求助]
噬菌体展示库淘选出抗体，怎么检测抗体与抗原的结合能力
|
||||
|
实验室前辈构建出噬菌体展示库了，我和同事一起做淘选工作，已经淘选出一批抗体，经过phage-ELISA检测挑选出数值比较高的单克隆，目前我们想利用HB2151来表达抗体，然后再检测表达出来的抗体与抗原的结合能力，这里我们遇到了难题： 我们的实验是这么安排的： 1.0.002ug/ul,100ul抗原包被，4°过夜 2.洗涤，2%脱脂牛奶封闭2h 3.洗涤，加入100ul 浓度未知的HB2151的表达抗体 4.洗涤，加入的0.2ug/ml的Anti-E-tag（该抗体试剂推荐的ELISA使用浓度） 5.洗涤，加入山羊抗兔IgG (H+L)（该抗体试剂推荐的ELISA使用浓度） 6.洗涤，TMB显色 7.终止反应，测值 因为第一次做此类实验，对于很多实验原理不是很清楚，设置对照时有点迷糊，望高手不要见笑： 1.PBS,实验组在用抗原包被时本对照组直接加的PBS，之后一直封闭，在上述实验进行到加一抗时，开始同步处理； 2.PBS+随机选取的HB2151表达的抗体，和前面一样，实验组抗原包被时本对照组直接加PBS，封闭后加入任选的表达抗体，之后实验同步处理； 但是实验结果却出人意料，实验组数值都很低，反倒是对照组1（只加了PBS的）数值最大，对照组2（PBS+随机选取的HB2151表达的抗体）次之。 百思不得其解，望高手不吝赐教，如果是我们设置的对照不正确误导了我们，望给出正确的对照设计，另在实验中在加抗体与抗原结合时是否需要加入合适浓度的封闭剂防止非特异性结合？ 万分感谢！！！！ |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 噬菌体库筛选 | 噬菌体展示 |
» 猜你喜欢
人气不行了
已经有9人回复
-
没有任何消息-是不是就凉了
已经有6人回复
-
如果此刻你正在为国基感到焦虑，不妨来听听这首《基金之外》
已经有5人回复
-
2026国自然函评费到账
已经有19人回复
-
能否退出参与的面上项目解除限项
已经有21人回复
-
建议基金发布提前给出明确的时间点
已经有16人回复
-
今日不放榜？网传国自然预计 8 月 27 日可查结果
已经有21人回复
-
估计是周四
已经有4人回复
-
我面上完蛋了
已经有9人回复
-
范进中举一文的中心思想
已经有7人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 检测限进样体积有要求吗
已经有4人回复
- 如何检测六甲基二硅氮烷是否变质
已经有2人回复
- 抗体非特异性结合
已经有8人回复
- 美国Bethy生物l公司（卖抗体和试剂盒）怎么样？
已经有4人回复
- 关于斑点检测抗体来源，做免疫印迹做不下去了，会不会是一抗出问题了？
已经有7人回复
- 请问ELISA中酶标抗体与待测抗原结合的原理是什么？
已经有6人回复
- 【求助/交流】求一些常用的配对的抗原抗体
已经有7人回复
- 【求助/交流】哪位同仁做过噬菌体肽库或者抗体库淘筛的，请一定要进来呀~~~~
已经有14人回复
- 【求助/交流】抗体能否转化为抗原
已经有9人回复
7楼2012-09-17 19:44:42
rhy1027
金虫 (正式写手)
- BioEPI: 6
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 6353.7
- 散金: 10
- 红花: 1
- 帖子: 370
- 在线: 108.4小时
- 虫号: 509301
- 注册: 2008-02-22
- 专业: 抗体工程学
【答案】应助回帖
★ ★ ★
hflf(金币+2): 2011-04-26 15:41:10
lstt09nk(金币+3): 辛苦~~ 2011-04-26 22:30:46
hflf(金币+2): 2011-04-26 15:41:10
lstt09nk(金币+3): 辛苦~~ 2011-04-26 22:30:46
|
从你的描述看，包板的抗原浓度是没问题的（0.5ug/ml我也常用，你的高四倍，更应该没问题了）！至于第二步你的目标展示抗体，相信你也是做了WB或者相关实验验证过才拿来这里做的。但你最好考虑定个量（例如用Biacore定量，最简单的format就是Immobilize antigen 在chip上，然后直接detect你的antibodies，analyze with biovalent model）。后面的两个抗体都是Commercial的，理论上说也不应该有问题！ 另：背景太高的问题，你可以换个blocking buffer。4%-5%的牛奶，或者Protein free blocking buffer也行，还有种chemical blocking buffer，可通过调节稀释倍数来决定block的强度！37度2h。 |
2楼2011-04-26 15:12:38
3楼2011-04-27 11:25:40
4楼2011-05-21 17:28:17
