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OD值偏高的问题 已有1人参与
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| 我是通过抗原免疫后测定血清中抗体效价问题，包被抗原5ug/ml,每孔100ul；封闭；血清采用倍比稀释，1:10,1:20……1:6400，每孔100ul；二抗结合，1:5000稀释；底物结合。最后结果对照组和实验组OD值偏高，高的达到了2.3左右，对照组OD值相对低一点，但是实验组与之相比未达到显著，求高人指点下问题出在哪了？bb不多，先谢过了！ |
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
疯狂的bamboo: 金币+15, ★★★很有帮助 2014-11-25 04:58:48
疯狂的bamboo: 金币+17, ★★★★★最佳答案, 完全解决了我的问题 我发现最主要的溶血影响了测定 换了血清之后就没问题了 另外我也把封闭时间延长了 非常感谢 2014-11-26 20:07:36
疯狂的bamboo: 回帖置顶 2014-11-26 20:08:08
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疯狂的bamboo: 回帖置顶 2014-11-26 20:08:08
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可能的原因：1.封闭不够完全，一般37度两小时，一小时勉强行（空白OD值高跟显色时间长短，显色试剂灵敏度都有关系） 2.二抗浓度过高，孵育时间过长，都容易出现OD值偏高。你这里的二抗时间温度没问题，稀释度跟所购试剂有关，这个确定一下不是太高。 3.采血确认是没有溶血情况，溶血会引起假阳性。 4.以上三者都没问题了，再看阴性对照跟实验组数据，如果相近的话，那就考虑抗原的问题了，或者獭兔所处环境接触到类似你说所用免疫原的物质。 |
11楼2014-11-24 21:37:53
2楼2014-11-23 22:21:38
3楼2014-11-23 22:37:41
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我是通过抑制素抗原免疫獭兔后测定抑制素（inhibin）抗体效价，下面是我的实验方案 1 用包被缓冲液将inhibin（当初注射用的抗原，inhibin完全重组蛋白）稀释至5ug/ml，每孔100ul，4℃过夜。次日洗涤三次，每次两分钟。 2 动物血清梯度稀释（1:10 1:100……1:1000000）后来改为（1:10,1:20……），每孔100ul，室温孵育1h，洗涤三次，同时做空白对照，阴性对照（就是我在实验中设的对照，未注射抗原） 3 加入新鲜稀释的酶标二抗（羊抗兔），1:5000稀释，100ul，室温孵育45min，洗涤 4 加入底物显色液TMB，新鲜配制，100ul每孔，室温15min 5 加2M 硫酸 200ul每孔，终止 6 elisa检测仪检测450nm处OD值 我原本是打算：比较实验组和阴性对照组的OD值确定阳性阴性的，但是测定的OD值（1）OD值普遍较高；（2）虽然同一稀释度下，实验组OD值高于对照组，但没有达到判定阳性的水平。可以确定的是：实验组中肯定有抑制素抗体，因为通过其他途径的激素变化已经确定了。是不是试验步骤 加量方面存在问题呀？？求指导 |
4楼2014-11-23 22:39:42