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muyuchc

木虫 (小有名气)

[求助] western抗体是怎么识别蛋白一级序列的 已有7人参与

有的western抗体是识别蛋白一级序列的，请问是怎么特异性识别的？
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1楼 2014-11-18 19:38:16
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muyuchc

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by xiaoyugutou at 2014-11-19 06:07:14
Maybe when they make antibody they immuned animals with peptides, so the antibody can recognize the primary sequence of protein as an antigen.

这个清楚，有没有具体的原理去识别的一级序列？
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3楼2014-11-19 10:06:51
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xiaoyugutou

捐助贵宾 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-11-19 08:22:30
Maybe when they make antibody they immuned animals with peptides, so the antibody can recognize the primary sequence of protein as an antigen.
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2楼2014-11-19 06:07:14
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youlinglyw

荣誉版主 (著名写手)

一匡天下

优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
muyuchc: 金币+10 2014-11-20 19:17:01
大多数情况下，抗体的制备是通过一级序列去制备的。

简单的回顾下抗体的制备方法
1构建表达载体
2原核表达
3纯化蛋白
4免疫动物制备抗体

发现没，经过1,2,3步骤，这是原核表达步骤，原核表达的蛋白
1没有活性，
2多肽为主。

因为原核表达的蛋白
1缺乏真核表达所需要的酶，所以无法正确折叠成蛋白
2缺乏真核表达所需要的内环境，细胞器等
3原核表达以包涵体表达为主，所以，经过那么强烈的ph变化和尿素处理最后纯化出来的蛋白，有活性才怪，基本上就是条肽链

那么，以上问题解决了，答案就很明显了，你用的一级序列去制备抗体，那么抗体能够识别的， 自然是一级序列了

然后问题来了，这种情况下，事实上，抗体是不特异的。所以，极少见那些可以用自己制备抗体做出非常单一漂亮的wb图片的
所以，如何解决？单克隆抗体嘿嘿，牛一点咋办，直接从生物里提取活的抗体，那样最有用，生化危机啦，猿星崛起啦，都是这么干的。
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天行健
4楼2014-11-19 10:42:55
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youlinglyw

荣誉版主 (著名写手)

一匡天下

优秀版主

【答案】应助回帖

以上内容主要是解决了你的标题问题

然后，问，有没方法去识别一级序列？

a，活性情况下，无法识别。这个如果非要是生物体内部的话，自然有方法了，相应的酶和结构会处理的

b，无活性情况下，可以识别。简单方法就是变性，成为了肽链，然后去测蛋白质序列就可以了，1953年，sanger最初就是测了胰岛素序列吧。
现在的话，一般是用打质谱然后拼接。

以上内容，答非所问。
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天行健
5楼2014-11-19 10:52:56
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