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shuibingyue

新虫 (小有名气)

[求助] 如何鉴定一个蛋白是AKT激酶的底物

想验证AKT能否将蛋白A的ser59位点磷酸化，除了放射性实验还有其他方法吗？A蛋白没有磷酸化抗体。请高手指教，不胜感激
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分子生化实验经验积累 【分子生物】EPI帖 核酸生物学实验经验 蛋白质生物学实验经验

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1楼2013-04-19 14:59:19
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
myprayer: MolEPI+1 2013-04-22 08:54:35
shuibingyue: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-04-22 15:35:13
其实也可以用简单的试验方法确定磷酸化位点，就是类似于对角线法确定二硫键的位点的方法，但是也可以不用双向电泳。你可以先将AKT与蛋白A混合入水溶液，取AKT最适合的反应条件，加入其它底物或者反应成分，充分反应后，分离出蛋白A，用胰蛋白酶水解后，用质谱测定未经与AKT混合的天然的同一种的蛋白A，两者对比各个肽段的分子量即可知道蛋白A的ser59位点是否磷酸化。上面说的质谱方法可以从头确定被磷酸化的全部氨基酸序列来确定具体的磷酸化位点。
但是也可以只用质谱测定Ser,Thr,Tyr残基所在的小肽段的质量变化来确定磷酸微点。可以现在磷酸化条件前后，用同种酶水解蛋白质A，然后可以做个肽谱分析，就是走个一维电泳，看哪个肽段在可能的磷酸化之后发生了质量变化，这很容易在电泳中显示出来，两次电泳位置发生变化的肽斑所在的凝胶块用刀切下来，回收后以没有磷酸化时的肽段测序，这样即使不知道整个蛋白质A的序列，也能测出磷酸肽上的具体磷酸化位点，当然要发文章，必须要知道蛋白质A的序列，这样才能知道磷酸化位点的具体位置。同时电泳本身就可以测定出各个肽段的分子量。

我把全部试验流程多说出来了，不知道楼主是否听明白了。
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7楼2013-04-21 22:07:05
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seanleon

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香。期待你的慷慨解囊。快乐每一天鼓励虫子来到生物版块交流，期待你的精彩1 2013-04-22 08:53:27
shuibingyue: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-04-22 15:20:16
gyesang: MolEPI+1, 牛人就是牛人，句句回答到点！ 2013-04-22 17:09:15
gyesang: 取消置顶 2013-05-04 13:26:51
gyesang: 回帖置顶 2013-05-04 13:27:10
1. 没有特异性抗体的情况下可以用AKT substrate的泛抗体检测，或者靠在phospho-tag胶电泳检测迁移率改变。
2. 要说明某蛋白是bona fide的AKT底物不是做做in vitro kinase assay就可以的。
3. 细胞培养液加入AKT抑制剂或者激活剂看目标蛋白在phospho-Tag胶的迁移率的变化。
4. 做该位点的Ser to Ala的点突变，看同样条件是否有迁移率的变化。
5. 敲低AKT看是否依然存在磷酸化。
6. 该位点附近序列是不是保守的AKT conserved phosphorylation motif。
7. 该位点的磷酸化对蛋白功能的影响是否和AKT的功能相关。
8. 激活或者抑制AKT的胞外刺激是否能同样影响该位点磷酸化水平。。。。。。。。。
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8楼2013-04-21 22:32:06
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★
myprayer: 金币+1, 应助指数+1, 赠人玫瑰手有余香。期待你的慷慨解囊。快乐每一天鼓励虫子来到生物版块交流，期待你的精彩1 2013-04-22 08:52:49
用于确定磷酸肽中的磷酸化位点的质谱方法有两种：第一种为ESI-CID，MALDI-PSD，通过磷酸脂键的断裂产生的特征离子鉴定；第二种为检测磷酸脂键基团使得肽段增加的质量数。通常在蛋白质磷酸化研究中的蛋白质的序列是已经知道的，如果不知道就用以Ediman降解为基础的自动多肽测序仪测定可能被磷酸化的蛋白质的序列也不是难事。因此可以通过对磷酸集团加合在Ser,Thr,Tyr残基上的引起的80道尔顿的质量数差的分析而检测出蛋白质产生的磷酸肽。所以通过MALDI-TOF-MS酶切指纹图谱后，通过质量测定值与预测值（完全没有磷酸化）的比较可以获得确定磷酸肽中的磷酸化位点定的确定位点。
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5楼2013-04-21 21:41:33
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

myprayer: 应助指数+1, EPI就该给予这样的牛人。 2013-04-22 08:54:10
补充一下，对于蛋白质的点突变本身就是研究蛋白质的折叠状态与折叠路径的一种实验方法，不要侥幸于突变了可能的重要功能位点的氨基酸残基而不会引起蛋白质整体折叠状态的改变，何况8楼的方案还是从基因表达水平改起，这样新生肽链的Ser to Ala，极性氨基酸突变为非极性氨基酸，很难预测蛋白质的折叠路径与最终折叠会有什么样的变化。况且，可能磷酸化的位点至少有Ser,Trp,Tyr,除此外可能还有His，难道要把这些氨基酸都依次突变一轮吗？
参见：Bret A.Shirley edits ,Protein Stablity and Folding----Protein and Practice,Huamana Press,1995,p271-290.
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10楼2013-04-21 23:54:24
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普通回帖

凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
shuibingyue: 金币+5, ★有帮助 2013-04-21 21:14:26
myprayer: 金币+1, 应助指数+1, 赠人玫瑰手有余香，鼓励应助，分子生物版块期待你的更多精彩。 2013-04-22 08:51:57
方法有很多，我随便说说。

楼主“想验证AKT能否将蛋白A的ser59位点磷酸化，除了放射性实验还有其他方法吗？”
问题的核心是检测出蛋白A的ser59位点磷酸化，那么就简单的检测方法用质谱检测出磷酸化的修饰位点，你要是经费充足，愿意用MS-MS测序也行，或者培养出单晶体进行X-ray diffraction，或者冷冻显微电镜观测也可以。

呵呵。。。说点经费花费少且能操作简单的：AKT与蛋白A混合入水溶液，取AKT最适合的反应条件，加入其它底物或者反应成分，充分反应后，分离出蛋白A，用胰蛋白酶水解后，用质谱测定未经与AKT混合的天然的同一种的蛋白A，两者对比各个肽段的分子量即可知道蛋白A的ser59位点是否磷酸化。
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2楼2013-04-19 18:23:29
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shuibingyue

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-04-19 18:23:29
方法有很多，我随便说说。

楼主“想验证AKT能否将蛋白A的ser59位点磷酸化，除了放射性实验还有其他方法吗？”
问题的核心是检测出蛋白A的ser59位点磷酸化，那么就简单的检测方法用质谱检测出磷酸化的修饰位点， ...

感谢回复，可能表述不清楚。其实重点在于验证该位点的激酶，质谱检测过此位点有磷酸化，预测其激酶为AKT。质谱检测蛋白磷酸化位点要求蛋白纯度高，且丰度大，您说的第二种方法是用原核表达纯化的AKT与蛋白A混合吗？MS-MS也只能知道那个小肽段有磷酸化吧。
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3楼2013-04-21 21:14:14
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by shuibingyue at 2013-04-21 21:14:14
感谢回复，可能表述不清楚。其实重点在于验证该位点的激酶，质谱检测过此位点有磷酸化，预测其激酶为AKT。质谱检测蛋白磷酸化位点要求蛋白纯度高，且丰度大，您说的第二种方法是用原核表达纯化的AKT与蛋白A混合吗？ ...

在目前的技术水平MS-MS能够确定具体的小肽段的磷酸化的具体氨基酸残基位点，即是具体序列。
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4楼2013-04-21 21:23:48
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

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6楼2013-04-21 21:52:11
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

直接用细胞外做磷酸化前后的有限酶解的肽链质量比对，再结合可能的修饰微点的氨基酸测定就可以出结果，完全不用点突变。做了点突变有时可能还引起蛋白质的折叠态的很大的改变，进而改变蛋白激酶的原有的作用位点（我说的非点突变的作用位点），所以8楼的实验方案我认为是可取的！
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9楼2013-04-21 23:44:25
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