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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

8楼的实验方案我认为是不可取的！

更正9楼（我写错了）
直接用细胞外做磷酸化前后的有限酶解的肽链质量比对，再结合可能的修饰微点的氨基酸测定就可以出结果，完全不用点突变。做了点突变有时可能还引起蛋白质的折叠态的很大的改变，进而改变蛋白激酶的原有的作用位点（我说的非点突变的作用位点），所以8楼的实验方案我认为是不可取的！这不仅是工作量大小的问题！
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11楼2013-04-21 23:56:01
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

8楼的方案"该位点附近序列是不是保守的AKT conserved phosphorylation motif。"

8楼的方案这一步仅仅是实验开始阶段有参考价值，而且如此必须先要知道目的蛋白质的完整的三维结构，很多蛋白质我们至今还不知道其三维结构，你这不方案可能根本没有存在的前提。别告诉我motif就是sequence motif，况且即使没有AKT conserved phosphorylation motif就可以认为没有磷酸化位点吗？AKT conserved phosphorylation motif来自于过去的发现。
别对我说用生物信息学软件就能够构建出完整的蛋白质的精确的客观的三维结构。

我提出的实验方案，即使不知道目的蛋白质的一级结构也能实现！大不了做个多肽自动化测序。
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12楼2013-04-22 00:04:22
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

综上所述，我认为：8楼提出的实验方案不可能成立！而不仅仅是操作过于繁琐！
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13楼2013-04-22 00:07:50
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shuibingyue

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by seanleon at 2013-04-21 22:32:06
1. 没有特异性抗体的情况下可以用AKT substrate的泛抗体检测，或者靠在phospho-tag胶电泳检测迁移率改变。
2. 要说明某蛋白是bona fide的AKT底物不是做做in vitro kinase assay就可以的。
3. 细胞培养液加入AKT抑 ...

感谢回复，phospho-Tag胶灵敏度高吗？之前没见人用过，看着很适合我的实验，这个是试剂盒吗？您用的是哪个公司的，可否给个链接？
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14楼2013-04-22 15:20:06
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shuibingyue

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-04-21 22:07:05
其实也可以用简单的试验方法确定磷酸化位点，就是类似于对角线法确定二硫键的位点的方法，但是也可以不用双向电泳。你可以先将AKT与蛋白A混合入水溶液，取AKT最适合的反应条件，加入其它底物或者反应成分，充分反应 ...

质谱测定Ser,Thr,Tyr残基所在的小肽段的质量变化来确定磷酸位点
这个方法也是体外混合AKT与蛋白A，反应前后同种酶水解蛋白A，走一维电泳。这个一维电泳的胶浓度该多大啊，蛋白A总共才15KD。

对于8楼的phospho-Tag胶您有听说过吗，因为我们实验室没有质谱，要送出去打质谱。
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15楼2013-04-22 15:35:04
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jemir

新虫 (著名写手)
没有特异的磷酸化抗体，可以做免疫共沉淀
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16楼2013-05-21 03:51:51
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