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shuibingyue

新虫 (小有名气)

[求助] 如何鉴定一个蛋白是AKT激酶的底物

想验证AKT能否将蛋白A的ser59位点磷酸化,除了放射性实验还有其他方法吗?A蛋白没有磷酸化抗体。请高手指教,不胜感激
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

综上所述,我认为:8楼提出的实验方案不可能成立!而不仅仅是操作过于繁琐!
13楼2013-04-22 00:07:50
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
shuibingyue: 金币+5, 有帮助 2013-04-21 21:14:26
myprayer: 金币+1, 应助指数+1, 赠人玫瑰手有余香,鼓励应助,分子生物版块期待你的更多精彩。 2013-04-22 08:51:57
方法有很多,我随便说说。

楼主“想验证AKT能否将蛋白A的ser59位点磷酸化,除了放射性实验还有其他方法吗?”
问题的核心是检测出蛋白A的ser59位点磷酸化,那么就简单的检测方法用质谱检测出磷酸化的修饰位点,你要是经费充足,愿意用MS-MS测序也行,或者培养出单晶体进行X-ray diffraction,或者冷冻显微电镜观测也可以。

呵呵。。。说点经费花费少且能操作简单的:AKT与蛋白A混合入水溶液,取AKT最适合的反应条件,加入其它底物或者反应成分,充分反应后,分离出蛋白A,用胰蛋白酶水解后,用质谱测定未经与AKT混合的天然的同一种的蛋白A,两者对比各个肽段的分子量即可知道蛋白A的ser59位点是否磷酸化。
2楼2013-04-19 18:23:29
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shuibingyue

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-04-19 18:23:29
方法有很多,我随便说说。

楼主“想验证AKT能否将蛋白A的ser59位点磷酸化,除了放射性实验还有其他方法吗?”
问题的核心是检测出蛋白A的ser59位点磷酸化,那么就简单的检测方法用质谱检测出磷酸化的修饰位点, ...

感谢回复,可能表述不清楚。其实重点在于验证该位点的激酶,质谱检测过此位点有磷酸化,预测其激酶为AKT。质谱检测蛋白磷酸化位点要求蛋白纯度高,且丰度大,您说的第二种方法是用原核表达纯化的AKT与蛋白A混合吗?MS-MS也只能知道那个小肽段有磷酸化吧。
3楼2013-04-21 21:14:14
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by shuibingyue at 2013-04-21 21:14:14
感谢回复,可能表述不清楚。其实重点在于验证该位点的激酶,质谱检测过此位点有磷酸化,预测其激酶为AKT。质谱检测蛋白磷酸化位点要求蛋白纯度高,且丰度大,您说的第二种方法是用原核表达纯化的AKT与蛋白A混合吗? ...

在目前的技术水平MS-MS能够确定具体的小肽段的磷酸化的具体氨基酸残基位点,即是具体序列。
4楼2013-04-21 21:23:48
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