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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 如何鉴定一个蛋白是AKT激酶的底物
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shuibingyue

新虫 (小有名气)

[求助] 如何鉴定一个蛋白是AKT激酶的底物

想验证AKT能否将蛋白A的ser59位点磷酸化，除了放射性实验还有其他方法吗？A蛋白没有磷酸化抗体。请高手指教，不胜感激
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分子生化实验经验积累 【分子生物】EPI帖 核酸生物学实验经验 蛋白质生物学实验经验

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1楼 2013-04-19 14:59:19
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shuibingyue

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-04-19 18:23:29
方法有很多，我随便说说。

楼主“想验证AKT能否将蛋白A的ser59位点磷酸化，除了放射性实验还有其他方法吗？”
问题的核心是检测出蛋白A的ser59位点磷酸化，那么就简单的检测方法用质谱检测出磷酸化的修饰位点， ...

感谢回复，可能表述不清楚。其实重点在于验证该位点的激酶，质谱检测过此位点有磷酸化，预测其激酶为AKT。质谱检测蛋白磷酸化位点要求蛋白纯度高，且丰度大，您说的第二种方法是用原核表达纯化的AKT与蛋白A混合吗？MS-MS也只能知道那个小肽段有磷酸化吧。
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3楼2013-04-21 21:14:14
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
shuibingyue: 金币+5, ★有帮助 2013-04-21 21:14:26
myprayer: 金币+1, 应助指数+1, 赠人玫瑰手有余香，鼓励应助，分子生物版块期待你的更多精彩。 2013-04-22 08:51:57
方法有很多，我随便说说。

楼主“想验证AKT能否将蛋白A的ser59位点磷酸化，除了放射性实验还有其他方法吗？”
问题的核心是检测出蛋白A的ser59位点磷酸化，那么就简单的检测方法用质谱检测出磷酸化的修饰位点，你要是经费充足，愿意用MS-MS测序也行，或者培养出单晶体进行X-ray diffraction，或者冷冻显微电镜观测也可以。

呵呵。。。说点经费花费少且能操作简单的：AKT与蛋白A混合入水溶液，取AKT最适合的反应条件，加入其它底物或者反应成分，充分反应后，分离出蛋白A，用胰蛋白酶水解后，用质谱测定未经与AKT混合的天然的同一种的蛋白A，两者对比各个肽段的分子量即可知道蛋白A的ser59位点是否磷酸化。
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2楼2013-04-19 18:23:29
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by shuibingyue at 2013-04-21 21:14:14
感谢回复，可能表述不清楚。其实重点在于验证该位点的激酶，质谱检测过此位点有磷酸化，预测其激酶为AKT。质谱检测蛋白磷酸化位点要求蛋白纯度高，且丰度大，您说的第二种方法是用原核表达纯化的AKT与蛋白A混合吗？ ...

在目前的技术水平MS-MS能够确定具体的小肽段的磷酸化的具体氨基酸残基位点，即是具体序列。
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4楼2013-04-21 21:23:48
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★
myprayer: 金币+1, 应助指数+1, 赠人玫瑰手有余香。期待你的慷慨解囊。快乐每一天鼓励虫子来到生物版块交流，期待你的精彩1 2013-04-22 08:52:49
用于确定磷酸肽中的磷酸化位点的质谱方法有两种：第一种为ESI-CID，MALDI-PSD，通过磷酸脂键的断裂产生的特征离子鉴定；第二种为检测磷酸脂键基团使得肽段增加的质量数。通常在蛋白质磷酸化研究中的蛋白质的序列是已经知道的，如果不知道就用以Ediman降解为基础的自动多肽测序仪测定可能被磷酸化的蛋白质的序列也不是难事。因此可以通过对磷酸集团加合在Ser,Thr,Tyr残基上的引起的80道尔顿的质量数差的分析而检测出蛋白质产生的磷酸肽。所以通过MALDI-TOF-MS酶切指纹图谱后，通过质量测定值与预测值（完全没有磷酸化）的比较可以获得确定磷酸肽中的磷酸化位点定的确定位点。
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5楼2013-04-21 21:41:33
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