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南方科技大学公共卫生及应急管理学院2025级博士研究生招生报考通知
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
myprayer: MolEPI+1 2013-04-22 08:54:35
shuibingyue: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-04-22 15:35:13
其实也可以用简单的试验方法确定磷酸化位点,就是类似于对角线法确定二硫键的位点的方法,但是也可以不用双向电泳。你可以先将AKT与蛋白A混合入水溶液,取AKT最适合的反应条件,加入其它底物或者反应成分,充分反应后,分离出蛋白A,用胰蛋白酶水解后,用质谱测定未经与AKT混合的天然的同一种的蛋白A,两者对比各个肽段的分子量即可知道蛋白A的ser59位点是否磷酸化。上面说的质谱方法可以从头确定被磷酸化的全部氨基酸序列来确定具体的磷酸化位点。
但是也可以只用质谱测定Ser,Thr,Tyr残基所在的小肽段的质量变化来确定磷酸微点。可以现在磷酸化条件前后,用同种酶水解蛋白质A,然后可以做个肽谱分析,就是走个一维电泳,看哪个肽段在可能的磷酸化之后发生了质量变化,这很容易在电泳中显示出来,两次电泳位置发生变化的肽斑所在的凝胶块用刀切下来,回收后以没有磷酸化时的肽段测序,这样即使不知道整个蛋白质A的序列,也能测出磷酸肽上的具体磷酸化位点,当然要发文章,必须要知道蛋白质A的序列,这样才能知道磷酸化位点的具体位置。同时电泳本身就可以测定出各个肽段的分子量。

我把全部试验流程多说出来了,不知道楼主是否听明白了。
7楼2013-04-21 22:07:05
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seanleon

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香。期待你的慷慨解囊。快乐每一天鼓励虫子来到生物版块交流,期待你的精彩1 2013-04-22 08:53:27
shuibingyue: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-04-22 15:20:16
gyesang: MolEPI+1, 牛人就是牛人,句句回答到点! 2013-04-22 17:09:15
gyesang: 取消置顶 2013-05-04 13:26:51
gyesang: 回帖置顶 2013-05-04 13:27:10
1. 没有特异性抗体的情况下可以用AKT substrate的泛抗体检测,或者靠在phospho-tag胶电泳检测迁移率改变。
2. 要说明某蛋白是bona fide的AKT底物不是做做in vitro kinase assay就可以的。
3. 细胞培养液加入AKT抑制剂或者激活剂看目标蛋白在phospho-Tag胶的迁移率的变化。
4. 做该位点的Ser to Ala的点突变,看同样条件是否有迁移率的变化。
5. 敲低AKT看是否依然存在磷酸化。
6. 该位点附近序列是不是保守的AKT conserved phosphorylation motif。
7. 该位点的磷酸化对蛋白功能的影响是否和AKT的功能相关。
8. 激活或者抑制AKT的胞外刺激是否能同样影响该位点磷酸化水平。。。。。。。。。
8楼2013-04-21 22:32:06
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