| 查看: 4497 | 回复: 15 | ||||||
| 本帖产生 2 个 MolEPI ，点击这里进行查看 | ||||||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||||||
[求助]
如何鉴定一个蛋白是AKT激酶的底物
|
||||||
| 想验证AKT能否将蛋白A的ser59位点磷酸化，除了放射性实验还有其他方法吗？A蛋白没有磷酸化抗体。请高手指教，不胜感激 |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 分子生化实验经验积累 | 【分子生物】EPI帖 | 核酸生物学实验经验 | 蛋白质生物学实验经验 |
» 猜你喜欢
富马酸贝达喹啉：二芳基喹啉类工具化合物的化学特征
已经有0人回复
-
BT投稿with editor状态快两周了，正常吗
已经有25人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有238人回复
-
Silevertinib（BDTX-1535）结构拆解：炔基双环片段为何成为合成瓶颈
已经有0人回复
-
RO4929097 解析：双苯并氮杂䓬骨架与 Notch 通路实验设计要点
已经有0人回复
-
分子量 1157 的 PROTAC 怎么配不析出：SGK3-PROTAC1 的溶解、分装与图谱复核
已经有0人回复
-
logP 6.1 的羧酸怎么配母液：GSK 650394 的溶解窗口与稀释顺序
已经有0人回复
-
从"水不溶"到 71 mg/mL：雷特格韦的 pH 依赖溶解与螯合色谱边界
已经有0人回复
-
133 Ų 的极性表面积，如何决定 TNG462 的母液配制与色谱条件
已经有0人回复
-
两个氟原子与一段氨基甲酸甲酯：BLU-5937 的母液配制与稳定性边界
已经有0人回复
-
司美那非（TPN171）：从嘧啶酮母核到工艺放大的结构、色谱与质控参数解析
已经有0人回复
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香。期待你的慷慨解囊。快乐每一天鼓励虫子来到生物版块交流，期待你的精彩1 2013-04-22 08:53:27
shuibingyue: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-04-22 15:20:16
gyesang: MolEPI+1, 牛人就是牛人，句句回答到点！ 2013-04-22 17:09:15
gyesang: 取消置顶 2013-05-04 13:26:51
gyesang: 回帖置顶 2013-05-04 13:27:10
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香。期待你的慷慨解囊。快乐每一天鼓励虫子来到生物版块交流，期待你的精彩1 2013-04-22 08:53:27
shuibingyue: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-04-22 15:20:16
gyesang: MolEPI+1, 牛人就是牛人，句句回答到点！ 2013-04-22 17:09:15
gyesang: 取消置顶 2013-05-04 13:26:51
gyesang: 回帖置顶 2013-05-04 13:27:10
|
1. 没有特异性抗体的情况下可以用AKT substrate的泛抗体检测，或者靠在phospho-tag胶电泳检测迁移率改变。 2. 要说明某蛋白是bona fide的AKT底物不是做做in vitro kinase assay就可以的。 3. 细胞培养液加入AKT抑制剂或者激活剂看目标蛋白在phospho-Tag胶的迁移率的变化。 4. 做该位点的Ser to Ala的点突变，看同样条件是否有迁移率的变化。 5. 敲低AKT看是否依然存在磷酸化。 6. 该位点附近序列是不是保守的AKT conserved phosphorylation motif。 7. 该位点的磷酸化对蛋白功能的影响是否和AKT的功能相关。 8. 激活或者抑制AKT的胞外刺激是否能同样影响该位点磷酸化水平。。。。。。。。。 |
8楼2013-04-21 22:32:06
凌波丽
专家顾问 (知名作家)
-
专家经验: +218 - MolEPI: 44
- 应助: 397 (硕士)
- 贵宾: 0.044
- 金币: 2119.9
- 散金: 10
- 红花: 209
- 帖子: 5633
- 在线: 571.6小时
- 虫号: 1766465
- 注册: 2012-04-19
- 性别: MM
- 专业: 生物大分子结构与功能
- 管辖: 生物科学综合
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
shuibingyue: 金币+5, ★有帮助 2013-04-21 21:14:26
myprayer: 金币+1, 应助指数+1, 赠人玫瑰手有余香，鼓励应助，分子生物版块期待你的更多精彩。 2013-04-22 08:51:57
感谢参与，应助指数 +1
shuibingyue: 金币+5, ★有帮助 2013-04-21 21:14:26
myprayer: 金币+1, 应助指数+1, 赠人玫瑰手有余香，鼓励应助，分子生物版块期待你的更多精彩。 2013-04-22 08:51:57
|
方法有很多，我随便说说。 楼主“想验证AKT能否将蛋白A的ser59位点磷酸化，除了放射性实验还有其他方法吗？” 问题的核心是检测出蛋白A的ser59位点磷酸化，那么就简单的检测方法用质谱检测出磷酸化的修饰位点，你要是经费充足，愿意用MS-MS测序也行，或者培养出单晶体进行X-ray diffraction，或者冷冻显微电镜观测也可以。 呵呵。。。说点经费花费少且能操作简单的：AKT与蛋白A混合入水溶液，取AKT最适合的反应条件，加入其它底物或者反应成分，充分反应后，分离出蛋白A，用胰蛋白酶水解后，用质谱测定未经与AKT混合的天然的同一种的蛋白A，两者对比各个肽段的分子量即可知道蛋白A的ser59位点是否磷酸化。 |
2楼2013-04-19 18:23:29
3楼2013-04-21 21:14:14
凌波丽
专家顾问 (知名作家)
-
专家经验: +218 - MolEPI: 44
- 应助: 397 (硕士)
- 贵宾: 0.044
- 金币: 2119.9
- 散金: 10
- 红花: 209
- 帖子: 5633
- 在线: 571.6小时
- 虫号: 1766465
- 注册: 2012-04-19
- 性别: MM
- 专业: 生物大分子结构与功能
- 管辖: 生物科学综合
4楼2013-04-21 21:23:48
10