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如何鉴定一个蛋白是AKT激酶的底物
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| 想验证AKT能否将蛋白A的ser59位点磷酸化，除了放射性实验还有其他方法吗？A蛋白没有磷酸化抗体。请高手指教，不胜感激 |
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1. 没有特异性抗体的情况下可以用AKT substrate的泛抗体检测，或者靠在phospho-tag胶电泳检测迁移率改变。 2. 要说明某蛋白是bona fide的AKT底物不是做做in vitro kinase assay就可以的。 3. 细胞培养液加入AKT抑制剂或者激活剂看目标蛋白在phospho-Tag胶的迁移率的变化。 4. 做该位点的Ser to Ala的点突变，看同样条件是否有迁移率的变化。 5. 敲低AKT看是否依然存在磷酸化。 6. 该位点附近序列是不是保守的AKT conserved phosphorylation motif。 7. 该位点的磷酸化对蛋白功能的影响是否和AKT的功能相关。 8. 激活或者抑制AKT的胞外刺激是否能同样影响该位点磷酸化水平。。。。。。。。。 |
8楼2013-04-21 22:32:06
凌波丽
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方法有很多，我随便说说。 楼主“想验证AKT能否将蛋白A的ser59位点磷酸化，除了放射性实验还有其他方法吗？” 问题的核心是检测出蛋白A的ser59位点磷酸化，那么就简单的检测方法用质谱检测出磷酸化的修饰位点，你要是经费充足，愿意用MS-MS测序也行，或者培养出单晶体进行X-ray diffraction，或者冷冻显微电镜观测也可以。 呵呵。。。说点经费花费少且能操作简单的：AKT与蛋白A混合入水溶液，取AKT最适合的反应条件，加入其它底物或者反应成分，充分反应后，分离出蛋白A，用胰蛋白酶水解后，用质谱测定未经与AKT混合的天然的同一种的蛋白A，两者对比各个肽段的分子量即可知道蛋白A的ser59位点是否磷酸化。 |
2楼2013-04-19 18:23:29
3楼2013-04-21 21:14:14
凌波丽
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4楼2013-04-21 21:23:48