应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 如何鉴定一个蛋白是AKT激酶的底物
51/1返回列表
查看: 3907  |  回复: 15
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
本帖产生 2 个 MolEPI ，点击这里进行查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

shuibingyue

新虫 (小有名气)

[求助] 如何鉴定一个蛋白是AKT激酶的底物

想验证AKT能否将蛋白A的ser59位点磷酸化，除了放射性实验还有其他方法吗？A蛋白没有磷酸化抗体。请高手指教，不胜感激
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

分子生化实验经验积累 【分子生物】EPI帖 核酸生物学实验经验 蛋白质生物学实验经验

» 猜你喜欢
1楼 2013-04-19 14:59:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

seanleon

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香。期待你的慷慨解囊。快乐每一天鼓励虫子来到生物版块交流，期待你的精彩1 2013-04-22 08:53:27
shuibingyue: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-04-22 15:20:16
gyesang: MolEPI+1, 牛人就是牛人，句句回答到点！ 2013-04-22 17:09:15
gyesang: 取消置顶 2013-05-04 13:26:51
gyesang: 回帖置顶 2013-05-04 13:27:10
1. 没有特异性抗体的情况下可以用AKT substrate的泛抗体检测，或者靠在phospho-tag胶电泳检测迁移率改变。
2. 要说明某蛋白是bona fide的AKT底物不是做做in vitro kinase assay就可以的。
3. 细胞培养液加入AKT抑制剂或者激活剂看目标蛋白在phospho-Tag胶的迁移率的变化。
4. 做该位点的Ser to Ala的点突变，看同样条件是否有迁移率的变化。
5. 敲低AKT看是否依然存在磷酸化。
6. 该位点附近序列是不是保守的AKT conserved phosphorylation motif。
7. 该位点的磷酸化对蛋白功能的影响是否和AKT的功能相关。
8. 激活或者抑制AKT的胞外刺激是否能同样影响该位点磷酸化水平。。。。。。。。。
赞一下 回复此楼
8楼2013-04-21 22:32:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 16 个回答

凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
shuibingyue: 金币+5, ★有帮助 2013-04-21 21:14:26
myprayer: 金币+1, 应助指数+1, 赠人玫瑰手有余香，鼓励应助，分子生物版块期待你的更多精彩。 2013-04-22 08:51:57
方法有很多，我随便说说。

楼主“想验证AKT能否将蛋白A的ser59位点磷酸化，除了放射性实验还有其他方法吗？”
问题的核心是检测出蛋白A的ser59位点磷酸化，那么就简单的检测方法用质谱检测出磷酸化的修饰位点，你要是经费充足，愿意用MS-MS测序也行，或者培养出单晶体进行X-ray diffraction，或者冷冻显微电镜观测也可以。

呵呵。。。说点经费花费少且能操作简单的：AKT与蛋白A混合入水溶液，取AKT最适合的反应条件，加入其它底物或者反应成分，充分反应后，分离出蛋白A，用胰蛋白酶水解后，用质谱测定未经与AKT混合的天然的同一种的蛋白A，两者对比各个肽段的分子量即可知道蛋白A的ser59位点是否磷酸化。
赞一下 回复此楼
2楼2013-04-19 18:23:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shuibingyue

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-04-19 18:23:29
方法有很多，我随便说说。

楼主“想验证AKT能否将蛋白A的ser59位点磷酸化，除了放射性实验还有其他方法吗？”
问题的核心是检测出蛋白A的ser59位点磷酸化，那么就简单的检测方法用质谱检测出磷酸化的修饰位点， ...

感谢回复，可能表述不清楚。其实重点在于验证该位点的激酶，质谱检测过此位点有磷酸化，预测其激酶为AKT。质谱检测蛋白磷酸化位点要求蛋白纯度高，且丰度大，您说的第二种方法是用原核表达纯化的AKT与蛋白A混合吗？MS-MS也只能知道那个小肽段有磷酸化吧。
赞一下 回复此楼
3楼2013-04-21 21:14:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by shuibingyue at 2013-04-21 21:14:14
感谢回复，可能表述不清楚。其实重点在于验证该位点的激酶，质谱检测过此位点有磷酸化，预测其激酶为AKT。质谱检测蛋白磷酸化位点要求蛋白纯度高，且丰度大，您说的第二种方法是用原核表达纯化的AKT与蛋白A混合吗？ ...

在目前的技术水平MS-MS能够确定具体的小肽段的磷酸化的具体氨基酸残基位点，即是具体序列。
赞一下 回复此楼
4楼2013-04-21 21:23:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 16 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 290分调剂求助 +3 吉祥止止陈 2026-03-25 3/150 2026-03-25 19:58 by barlinike
[考研] 材料专硕 335 分求调剂 +4 拒绝冷暴力 2026-03-25 4/200 2026-03-25 18:45 by haxia
[考研] 考研一志愿苏州大学初始315（英一）求调剂 +3 sbdksD 2026-03-24 4/200 2026-03-25 18:16 by xcjcqu
[考研] 0854AI CV方向招收调剂 +4 章小鱼567 2026-03-23 4/200 2026-03-25 17:04 by CoderLoser
[考研] 0854人工智能方向招收调剂 +4 章小鱼567 2026-03-24 4/200 2026-03-25 13:29 by 2177681040
[考研] 07化学280分求调剂 +7 722865 2026-03-23 7/350 2026-03-25 09:29 by aa331100
[考研] 化学调剂 +6 yzysaa 2026-03-21 6/300 2026-03-25 09:27 by aa331100
[考研] 生物学学硕求调剂 +7 小羊睡着了? 2026-03-23 10/500 2026-03-25 02:24 by 清风拂扬。 m
[考研] 一志愿武理085500机械专业总分300求调剂 +3 an10101 2026-03-24 7/350 2026-03-25 00:00 by 山鬼0-
[考研] 335求调剂 +4 yuyu宇 2026-03-23 5/250 2026-03-23 23:49 by Txy@872106
[考研] 一志愿国科过程所081700，274求调剂 +3 三水研0水立方 2026-03-23 3/150 2026-03-23 23:11 by MajorWen
[考研] 384求调剂 +3 子系博 2026-03-22 6/300 2026-03-23 21:45 by 子系博
[考研] 石河子大学（211、双一流）硕博研究生长期招生公告 +3 李子目 2026-03-22 3/150 2026-03-22 21:01 by 怎么释怀
[考研] 260求调剂 +3 朱芷琳 2026-03-20 4/200 2026-03-22 15:12 by 朱芷琳
[考研] 311求调剂 +3 26研0 2026-03-20 3/150 2026-03-22 14:46 by ColorlessPI
[考研] 一志愿华中科技大学071000，求调剂 +4 沿岸有贝壳6 2026-03-21 4/200 2026-03-22 07:21 by ilovexiaobin
[考研] 0703化学297求调剂 +3 Daisy☆ 2026-03-20 3/150 2026-03-21 17:45 by ColorlessPI
[基金申请] 学校已经提交到NSFC，还能修改吗？ 40+4 babangida 2026-03-19 9/450 2026-03-21 16:12 by babangida
[考研] 279求调剂 +5 红衣隐官 2026-03-21 5/250 2026-03-21 14:59 by lature00
[考研] 22408 344分 求调剂 一志愿 华电计算机技术 +4 solanXXX 2026-03-20 4/200 2026-03-20 23:49 by alg094825
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭