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如何鉴定一个蛋白是AKT激酶的底物
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| 想验证AKT能否将蛋白A的ser59位点磷酸化，除了放射性实验还有其他方法吗？A蛋白没有磷酸化抗体。请高手指教，不胜感激 |
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凌波丽
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【答案】应助回帖
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myprayer: MolEPI+1 2013-04-22 08:54:35
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其实也可以用简单的试验方法确定磷酸化位点，就是类似于对角线法确定二硫键的位点的方法，但是也可以不用双向电泳。你可以先将AKT与蛋白A混合入水溶液，取AKT最适合的反应条件，加入其它底物或者反应成分，充分反应后，分离出蛋白A，用胰蛋白酶水解后，用质谱测定未经与AKT混合的天然的同一种的蛋白A，两者对比各个肽段的分子量即可知道蛋白A的ser59位点是否磷酸化。上面说的质谱方法可以从头确定被磷酸化的全部氨基酸序列来确定具体的磷酸化位点。 但是也可以只用质谱测定Ser,Thr,Tyr残基所在的小肽段的质量变化来确定磷酸微点。可以现在磷酸化条件前后，用同种酶水解蛋白质A，然后可以做个肽谱分析，就是走个一维电泳，看哪个肽段在可能的磷酸化之后发生了质量变化，这很容易在电泳中显示出来，两次电泳位置发生变化的肽斑所在的凝胶块用刀切下来，回收后以没有磷酸化时的肽段测序，这样即使不知道整个蛋白质A的序列，也能测出磷酸肽上的具体磷酸化位点，当然要发文章，必须要知道蛋白质A的序列，这样才能知道磷酸化位点的具体位置。同时电泳本身就可以测定出各个肽段的分子量。 我把全部试验流程多说出来了，不知道楼主是否听明白了。 |
7楼2013-04-21 22:07:05
凌波丽
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【答案】应助回帖
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shuibingyue: 金币+5, ★有帮助 2013-04-21 21:14:26
myprayer: 金币+1, 应助指数+1, 赠人玫瑰手有余香，鼓励应助，分子生物版块期待你的更多精彩。 2013-04-22 08:51:57
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方法有很多，我随便说说。 楼主“想验证AKT能否将蛋白A的ser59位点磷酸化，除了放射性实验还有其他方法吗？” 问题的核心是检测出蛋白A的ser59位点磷酸化，那么就简单的检测方法用质谱检测出磷酸化的修饰位点，你要是经费充足，愿意用MS-MS测序也行，或者培养出单晶体进行X-ray diffraction，或者冷冻显微电镜观测也可以。 呵呵。。。说点经费花费少且能操作简单的：AKT与蛋白A混合入水溶液，取AKT最适合的反应条件，加入其它底物或者反应成分，充分反应后，分离出蛋白A，用胰蛋白酶水解后，用质谱测定未经与AKT混合的天然的同一种的蛋白A，两者对比各个肽段的分子量即可知道蛋白A的ser59位点是否磷酸化。 |
2楼2013-04-19 18:23:29
3楼2013-04-21 21:14:14
凌波丽
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4楼2013-04-21 21:23:48
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