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如何鉴定一个蛋白是AKT激酶的底物
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| 想验证AKT能否将蛋白A的ser59位点磷酸化，除了放射性实验还有其他方法吗？A蛋白没有磷酸化抗体。请高手指教，不胜感激 |
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凌波丽
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【答案】应助回帖
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8楼的方案"该位点附近序列是不是保守的AKT conserved phosphorylation motif。" 8楼的方案这一步仅仅是实验开始阶段有参考价值，而且如此必须先要知道目的蛋白质的完整的三维结构，很多蛋白质我们至今还不知道其三维结构，你这不方案可能根本没有存在的前提。别告诉我motif就是sequence motif，况且即使没有AKT conserved phosphorylation motif就可以认为没有磷酸化位点吗？AKT conserved phosphorylation motif来自于过去的发现。 别对我说用生物信息学软件就能够构建出完整的蛋白质的精确的客观的三维结构。 我提出的实验方案，即使不知道目的蛋白质的一级结构也能实现！大不了做个多肽自动化测序。 |
12楼2013-04-22 00:04:22
凌波丽
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【答案】应助回帖
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方法有很多，我随便说说。 楼主“想验证AKT能否将蛋白A的ser59位点磷酸化，除了放射性实验还有其他方法吗？” 问题的核心是检测出蛋白A的ser59位点磷酸化，那么就简单的检测方法用质谱检测出磷酸化的修饰位点，你要是经费充足，愿意用MS-MS测序也行，或者培养出单晶体进行X-ray diffraction，或者冷冻显微电镜观测也可以。 呵呵。。。说点经费花费少且能操作简单的：AKT与蛋白A混合入水溶液，取AKT最适合的反应条件，加入其它底物或者反应成分，充分反应后，分离出蛋白A，用胰蛋白酶水解后，用质谱测定未经与AKT混合的天然的同一种的蛋白A，两者对比各个肽段的分子量即可知道蛋白A的ser59位点是否磷酸化。 |
2楼2013-04-19 18:23:29
3楼2013-04-21 21:14:14
凌波丽
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4楼2013-04-21 21:23:48