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如何鉴定一个蛋白是AKT激酶的底物
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| 想验证AKT能否将蛋白A的ser59位点磷酸化，除了放射性实验还有其他方法吗？A蛋白没有磷酸化抗体。请高手指教，不胜感激 |
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myprayer: 应助指数+1, EPI就该给予这样的牛人。 2013-04-22 08:54:10
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补充一下，对于蛋白质的点突变本身就是研究蛋白质的折叠状态与折叠路径的一种实验方法，不要侥幸于突变了可能的重要功能位点的氨基酸残基而不会引起蛋白质整体折叠状态的改变，何况8楼的方案还是从基因表达水平改起，这样新生肽链的Ser to Ala，极性氨基酸突变为非极性氨基酸，很难预测蛋白质的折叠路径与最终折叠会有什么样的变化。况且，可能磷酸化的位点至少有Ser,Trp,Tyr,除此外可能还有His，难道要把这些氨基酸都依次突变一轮吗？ 参见：Bret A.Shirley edits ,Protein Stablity and Folding----Protein and Practice,Huamana Press,1995,p271-290. |
10楼2013-04-21 23:54:24
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shuibingyue: 金币+5, ★有帮助 2013-04-21 21:14:26
myprayer: 金币+1, 应助指数+1, 赠人玫瑰手有余香，鼓励应助，分子生物版块期待你的更多精彩。 2013-04-22 08:51:57
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方法有很多，我随便说说。 楼主“想验证AKT能否将蛋白A的ser59位点磷酸化，除了放射性实验还有其他方法吗？” 问题的核心是检测出蛋白A的ser59位点磷酸化，那么就简单的检测方法用质谱检测出磷酸化的修饰位点，你要是经费充足，愿意用MS-MS测序也行，或者培养出单晶体进行X-ray diffraction，或者冷冻显微电镜观测也可以。 呵呵。。。说点经费花费少且能操作简单的：AKT与蛋白A混合入水溶液，取AKT最适合的反应条件，加入其它底物或者反应成分，充分反应后，分离出蛋白A，用胰蛋白酶水解后，用质谱测定未经与AKT混合的天然的同一种的蛋白A，两者对比各个肽段的分子量即可知道蛋白A的ser59位点是否磷酸化。 |
2楼2013-04-19 18:23:29
3楼2013-04-21 21:14:14
凌波丽
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4楼2013-04-21 21:23:48
