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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

[交流] 蛋白质的共价修饰的测定的试验方法----凌波丽 个人总结已有7人参与

蛋白质的共价修饰的测定的试验方法
-------以糖基化修饰、有机小分子修饰和磷酸化修饰为例

凌波丽 个人总结

今天我看了几篇论坛里的有关的确认糖基和蛋白质中的氨基酸残基的侧链的结合位点的实验方法和有机分子共价修饰的蛋白质的质谱测定的试验方法的求助帖。我个人觉得：网友们的实验问题还是比较多，貌似没有人给出一些比较有代表性的试验方法的ideas,所以就螳螂挡臂，写了这个帖子，当是抛砖引玉吧。因为时间有限，我主要是谈一些比较有代表性的试验方法的ideas，至于其中实验细节，结合具体实验我们可以再讨论。

1.确定糖基和蛋白质结合位点的共价结合位点的方法。
方法很多，举例如下：
（1）基于NMR的方法。最简单的方法：可以用NMR解析结合糖基的蛋白质的完全的三维结构，要用自选量子数不为零的同位素加以标记（比如15N、13C）。能够直接获取糖蛋白的三级结构结构信息，包括糖基位点。
（2）基于质谱的方法。
实际上用串联质谱能够直接对于含有共价结合糖基的蛋白质进行测序，当然费用是较高的。要用串联质谱分析糖基化位点，不是貌似肽段谱图，而是貌似Ladder Sequencing，即Ediman降解结合质谱测定多肽序列，也就是用质谱代替凝胶电泳测定每一步Ediman降解之后减少一个氨基酸残基分子量的多肽段的相对分子量，但是现在能够用串联质谱直接测定多肽段的氨基酸序列了，不用在结合用Ediman降解。而且许多的多肽的糖基化、磷酸化、甲基化、乙酰化等各种共价的修饰，尤其是磷酸化修饰已经能够直接从质谱读出。
但是不幸的是糖分子不是线性分子，而是可能有很多分支。至少在分支位点必须用糖苷酶水解以确定分支的类型，目前的质谱还打不到能够区别糖链不同分支的水平。
（3）基于X-ray diffraction的方法。
用X-ray diffraction解析结合糖基的蛋白质的完全的三维结构，前提是能够获得结合糖基的蛋白质的单晶体。X-ray diffraction能够直接获取糖蛋白的三级结构结构信息，包括糖基位点。蛋白质的单晶体不一定必须只有一种单一的蛋白质，配体和受体相互作用的混合物也可能形成单晶体，比如核糖体的和小一段mRNA能形成单晶体并且用X-ray diffraction解析出原子水平的三维结构。
（4）基于肽谱分析的方法。事先要获得样品蛋白质的全序列（从数据库应该容易查到，实在没有再测序）；用强的螯合试剂夺取结合糖基的蛋白质中的糖基，得到脱糖基的蛋白质分子，然后用超滤除去螯合试剂和糖基，剩下脱糖基的蛋白质分子；分别用胰蛋白酶有限水解结合糖基的蛋白质和不结合结合糖基的蛋白质，分别过双向电泳，辨别出两次双向电泳图上位点不一样一样的多肽片段（能够读出相对分子量）的质谱峰；挖出位置不一样的两侧的电泳图上的肽斑回收其中肽段；对电泳图上位点不一样的多肽片段进行测序（Edman降解法即可，Edman降解法本身无法测定修饰的氨基酸，这本身也是一种信息）---------测定一部分知道多肽片段在整个序列中的位置即可，然后根据目的蛋白质的全序列中可能与糖基形成共价键的氨基酸的位点----在一级结构中的位置，判定出结合有糖基形成共价键的氨基酸的具体位点。

2.有机分子共价修饰的蛋白质的质谱测定的试验方法
以上用于糖基化测定的试验方法都可以用于有机分子（尤其是药物分子）共价修饰的蛋白质的质谱测定的试验方法。但是两者还有至少还有一点不同：糖基化在细胞里会正常存在，用酶完全去除不太容易，而有机分子（尤其是药物分子）共价修饰的蛋白质原来是不带有这类侧链基团的。所有两者的质谱测定方法并不相同。
对于一般的有机分子（尤其是药物分子）共价修饰的蛋白质的质谱测定。事先要获得样品蛋白质的全序列（从数据库应该容易查到，实在没有再测序）；分别用胰蛋白酶有限水解有机分子共价修饰蛋白质和还没有有机分子共价修饰蛋白质，分别过质谱，辨别出m/z不一样的多肽片段（能够读出相对分子量）的质谱峰；用分子筛层析分离出含有有机分子共价修饰和天然蛋白质分子质谱峰不一样的多肽片段（能够读出相对分子量）；取出以上质谱峰不一样的多肽片段（能够读出相对分子量），进行测序---------测定一部分知道多肽片段在整个序列中的位置即可，然后用串联质谱直接对于含有共价结合的有机分子的肽片段测序即可判定出结合有糖基形成共价键的氨基酸的具体位点（对比不含糖基的该段的质谱即可知道）。
当然因为有机分子共价修饰的的氨基酸我们还是能够确定的，所以直接用质谱测定时能够比较清楚地定位在有机分子共价修饰所在的肽片段，并用特异性的蛋白酶有限水解，得到蛋白质共价结合的有机分子所在的肽片段，然后走质谱，很容易确定分子量的变化和有机分子共价修饰的修饰位点。
我们现在甚至于不知道何种有机分子共价修饰了蛋白质，我们也可以通过质谱结合红外、紫外光谱而鉴定出共价修饰的有机分子的类型。

3.蛋白质的磷酸化检测。方法很多了：WB----现在有卖的磷酸化的蛋白质的单克隆抗体。双向电泳-----在磷酸化前后各做一次。质谱直接测定蛋白质的磷酸化的分子量变化。NMR测出磷酸化后的蛋白质的全构象。磷酸化的蛋白质的肽谱分析----先有限水解，再用二维电泳比较磷酸化前后的异常位置的肽斑。X-ray diffraction解析出磷酸化蛋白质的原子水平的全构象。


（仅供参考）

例1.求一个化合物对一种酶的抑制类型
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6048410
也可见：第15楼

例2.通过质谱的质量位移确定分子式
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6095316

[ Last edited by 凌波丽 on 2013-7-11 at 01:00 ]
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1楼2013-06-21 02:56:15
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
蛋白质的共价修饰本身也是一种非常有效的试验方法，经常能够代替基因的点突变然后完成基因工程的全过程，尤其是对我这样的非常懒惰人非常有吸引力。
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2楼2013-06-21 03:01:33
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
我没有写糖蛋白和有机（药物）分子共价修饰的蛋白质的免疫检测方法，但实际上也是可用的，无非是制备出相应的单克隆抗体。

此三贴仅仅是凌波丽个人总结和抛砖引玉。
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3楼2013-06-21 03:07:40
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yuanalice

银虫 (小有名气)
抢沙发呀！
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4楼2013-06-21 10:24:54
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ynkuaile

木虫 (小有名气)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
myprayer: 金币+1, Gifts of roses, hand there are lingering fragrance. Look forward to your wonderful and more detailed answer. 2013-06-21 13:51:52
NMR, X-ray，质谱.(蛋白质磷酸化检测不说)，通过这几种方法来检测是否共价连接。最可行的是质谱，并且能分辨出连接位点。后续有可能的话才做NMR,X-ray。做结构的都知道，NMR结构解析需要多久的时间，X-ray晶体的生长需要多久的时间。万一解出结构不是自己想要的，那时间真的是浪费了。更别说NMR解不出结构，X-ray长不出晶体，那毕业就难喽。觉得可行的就是质谱。当然，判断共价还有其他办法，但没那么通用。
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5楼2013-06-21 11:16:12
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甜甜520smile
6楼2013-06-21 11:36:17
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ynkuaile

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
补充楼上，NMR解析糖基化蛋白的结构可以，但是NMR不能判断分子间相互作用形成的是什么键，他只能说明有相互作用，并不能说明是共价相连。这种方法也不能通用于判断连接方式。解释糖基化蛋白还是可以的。相对而言，判断结合方式，还是做质谱吧。
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7楼2013-06-21 11:43:01
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
★
myprayer: 金币+1, Gifts of roses, hand there are lingering fragrance. Look forward to your wonderful and more detailed answer. 2013-06-21 13:52:10
引用回帖:
5楼: Originally posted by ynkuaile at 2013-06-21 11:16:12
NMR, X-ray，质谱.(蛋白质磷酸化检测不说)，通过这几种方法来检测是否共价连接。最可行的是质谱，并且能分辨出连接位点。后续有可能的话才做NMR,X-ray。做结构的都知道，NMR结构解析需要多久的时间，X-ray晶体的生长 ...

ynkuaile的意见很好！谢谢！。

我也做些补充说明：
1.NMR对于分子量不大于40KD的蛋白质解谱还是相对比较方便，计算机硬件和软件要强大。X-ray diffraction，我从来就不主张做，因为单晶培养本来就没有什么规律可言。

2.这贴是今天凌晨失眠时从头写的，没有写出实验顺序。
比如首先应该提取出修饰的蛋白质，对于高通量的提取修饰蛋白质，用其单克隆抗体进行Pull down是最为简单和可行的，但是用单克隆抗体无法确定具体的修饰位点。我写出来是因为其可以高通量提取修饰的蛋白质。

3.质谱当然是很好的工具，而且它不仅可以用于检测生物大分子（蛋白质、DNA、RNA等）共价修饰，还可以用于检测蛋白质-蛋白质相互作用，蛋白质-DNA相互作用，蛋白质-RNA相互作用，后三者只能用MADLI-MS.但是质谱也不是万能的，它本身不能提取物质，智能检测物质，而且蛋白质序列的氨基酸残基数量越大，质谱的误差就越高；因此必须用其他的研究技术先分离提取出修饰的蛋白质，还要把修饰位点所在的序列区域尽量的缩小，这步就需要用到光谱方法和有限酶解方法。

4.用各种光谱方法和单分子研究技术当然也可以用于蛋白质的共价修饰，比如CD，FTIR，荧光光谱，能量转移等，原子力显微镜和低温冷冻电子显微镜也可以。
圆二色光谱能够用于测定蛋白质二级结构的数量变化，结合FTIR，现已知的天然的蛋白质的空间结构（不知道的话，用生物信息学软件预测一下，如果连一级结构都不知道，用Edman降解大致测定一下序列，当然如果有人真的爆有钱且实在想花掉，那么也可以用MS-MS直接测序，但是MS-MS直接测序也要把蛋白质用酶切开，否则数据也较大），以及可能的共价修饰位点确定大致的修饰位置，然后按照概率大小，进行不同的蛋白水解酶有限酶解后再用质谱检测具体的修饰位点。
在光谱之后可以用肽谱分析，这样再用质谱检测具体的修饰位点效果更好。质谱检测具体的修饰位点效果可以作为一级结构上的共价修饰位点的确定的最后一步。其前期工作做得好一些，最后一步的压力就小，效率会更高，成果会更大。
在质谱之后可以在上NMR，x-ray diffraction,原子力显微镜和低温冷冻电子显微镜等解析空间结构,到了这一步事实上修饰位点的确定只是副产物或者验证而已，主要目的已经改变。但是作为可行的研究手段，我还是列出了。

欢迎补充更正。今天凌晨写完后太困了，没有研究流程写出，抱歉！

在对于ynkuaile表示感谢！
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8楼2013-06-21 11:54:52
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
引用回帖:
7楼: Originally posted by ynkuaile at 2013-06-21 11:43:01
补充楼上，NMR解析糖基化蛋白的结构可以，但是NMR不能判断分子间相互作用形成的是什么键，他只能说明有相互作用，并不能说明是共价相连。这种方法也不能通用于判断连接方式。解释糖基化蛋白还是可以的。相对而言，判 ...

不少时候，化学键的确定一般是通过跨越共价修饰位点的相邻的原子的种类与排列来大致确定，所以NMR解析了蛋白质的原子水平上的完全的空间结构可以大致确定相邻的原子的化学键的类型，即使不能直接用NMR、x-ray diffraction和低温冷冻电子显微镜解析获知共价修饰位点的相邻的原子的种类与排列也是解析化学键的基础。
下一步可以用红外、紫外、质谱、荧光光谱具体确定化学键的类型，但是如果完全不知道修饰位点和跨越共价修饰位点的相邻的原子的种类与排列，红外、紫外、质谱、荧光光谱具体确定化学键的类型的信号信息会太多太杂。

我说的各种检测方法实际上应该构成一个系统，而非单列，第一帖没有说明白。抱歉！
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9楼2013-06-21 12:06:00
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
引用回帖:
7楼: Originally posted by ynkuaile at 2013-06-21 11:43:01
补充楼上，NMR解析糖基化蛋白的结构可以，但是NMR不能判断分子间相互作用形成的是什么键，他只能说明有相互作用，并不能说明是共价相连。这种方法也不能通用于判断连接方式。解释糖基化蛋白还是可以的。相对而言，判 ...

不对！NMR能够确定共价键的存在！并且能够在原子水平上解析蛋白质的构象！

请见：Kurt Wüthrich,NMP of Proteins and Nucleic Acids,A Wily -Interscience Publication,1986;
胡皆汉，胡加尼 著，破释分子-----分子化学结构探究例解，科学出版社，2006.
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10楼2013-06-21 12:31:18
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