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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 蛋白质的共价修饰的测定的试验方法----凌波丽 个人总结
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
第7 楼说的不对！NMR能够确定共价键的存在！并且能够在原子水平上解析蛋白质的构象！化学位移值会因为化学键和链接原子的不同而有差异，NMR能够同样能够研究分子间的非共价的相互作用。

请见：Kurt Wüthrich,NMP of Proteins and Nucleic Acids,A Wily -Interscience Publication,1986;
胡皆汉，胡加尼 著，破释分子-----分子化学结构探究例解，科学出版社，2006.
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11楼2013-06-21 12:33:59
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
更正：参考文献写错了，正确的是：Kurt Wüthrich,NMR of Proteins and Nucleic Acids,A Wily -Interscience Publication,1986，原来把NMR写成了NMP。
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12楼2013-06-21 14:45:14
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96Kge

木虫 (小有名气)
送红花一朵
支持原创！！
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♡❤.陈老师.Edison.Chen.❤♡
13楼2013-06-22 13:29:31
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
引用回帖:
13楼: Originally posted by 96Kge at 2013-06-22 13:29:31
支持原创！！

欢迎到分子生物学版。
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14楼2013-06-22 20:18:29
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
加上第一个应用的实例：

例1.求一个化合物对一种酶的抑制类型

http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6048410

      本例强调了红外光谱和质谱在蛋白质的共价修饰的检测中的应用，和实际检测时的工作程序。

   本例的基本原理：“判定一个抑制剂对于某种酶是否为可逆抑制剂的试验方法”如下文所述，完整讨论请见原帖。

　　                   判定一个抑制剂对于某种酶是否为可逆抑制剂的试验方法

　　一个抑制剂对于酶是可逆抑制，还是不可逆抑制，判断方法不止一种。酶的不可逆抑制剂与酶分子的链接是共价连接，也就是说两者之间形成了新的共价键，而不是次级键。那么所有的用于蛋白质的共价修饰的研究技术也都可以适用于不可逆抑制剂对于酶分子的抑制作用。
　　首先要先行确定一个抑制剂对于某种酶是可逆抑制，还是不可逆抑制，比较简单的方法有：如果是该抑制剂对于酶是不可逆修饰剂，则有：1.对于加入抑制剂的酶-底物溶液（处于最适合酶促放映状态）的酶活力明显的降低；2.用红外傅里叶变换光谱仪检测加入对于加入抑制剂的酶-底物溶液（处于最适合酶促放映状态）的酶分子与同样条件下没有加入抑制剂的酶-底物溶液（处于最适合酶促反应状态）的酶分子相比较，有新的共价键形成。同时鉴别出此共价键不是没、底物、抑制剂所原有的共价键的红外傅里叶变换光谱。
　　然后用质谱检测酶促反应结束之后的酶分子的质量变大了即可确定了该酶的确受到了不可逆抑制剂的作用。
　　最后还可以质谱检测具体的不可逆修饰剂与酶分子的共价连接的位点，有限酶解有不可逆修饰剂修饰和无不可逆修饰剂修饰的同种酶，然后比较各个片段的相对分子量变化，然后再根据酶的一级结构的氨基酸序列中可能与抑制剂分子发生共价聚合的氨基酸侧链推测可能的结合位点，并且进一步缩小肽段，最后逐步逼近被修饰的氨基酸位点。
　　
　　以上情况是比较理想的情况，如果一个抑制剂对于某种酶是不可逆抑制，用红外傅里叶变换光谱仪检测加入对于加入抑制剂的酶-底物溶液（处于最适合酶促放映状态）的酶分子与同样条件下没有加入抑制剂的酶-底物溶液（处于最适合酶促反应状态）的酶分子相比较，不能判断出是否有新的共价键形成，比如形成的是与原先的酶或者底物或者抑制剂本身就有的固有共价键相同的新的共价键，此时就不能通过红外傅里叶变换光谱仪检测出新的共价键的特有吸收峰。但是又的确存在酶的活力受到抑制的情况，下面如何做？
　　直接用质谱检测酶促反应结束之后的酶分子的质量变大了即可确定了该酶的确受到了不可逆抑制剂的作用。
　　最后一步与前面一样，用质谱检测具体的不可逆修饰剂与酶分子的共价连接的位点，有限酶解有不可逆修饰剂修饰和无不可逆修饰剂修饰的同种酶，然后比较各个片段的相对分子量变化，然后再根据酶的一级结构的氨基酸序列中可能与抑制剂分子发生共价聚合的氨基酸侧链推测可能的结合位点，并且进一步缩小肽段，最后逐步逼近被修饰的氨基酸位点。
　　
　　以上用有限酶解候质谱检测的部分也可以改成“肽谱分析”------有限酶解蛋白质后，对于肽段走双向电泳。
　　
　　如果我们不放入底物进入酶溶液，直接加入抑制剂，然后重复以上两种检测过程行不行？这样做可以作为补充的实验，但是不能只用第三种方法。因为有些抑制剂，可能在没有酶促反应发生时，也不与酶共价结合，如同可逆制宜抑制的反竞争性抑制剂。
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15楼2013-07-06 12:37:53
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yanlinchun

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
3楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-06-21 03:07:40
我没有写糖蛋白和有机（药物）分子共价修饰的蛋白质的免疫检测方法，但实际上也是可用的，无非是制备出相应的单克隆抗体。

此三贴仅仅是凌波丽个人总结和抛砖引玉。

凌波丽会不会成为一个广告标签呢？
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16楼2013-07-08 16:50:40
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
例2.通过质谱的质量位移确定分子式

http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6095316
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17楼2013-07-11 00:57:18
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calorimetry
送红花一朵
18楼2015-06-17 17:11:07
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15851406596

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
楼主 为什么要做糖基化位点鉴定？糖基化位点鉴定的意义是什么？是为了后续的质量控制吗
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19楼2017-10-30 15:01:45
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15851406596

新虫 (初入文坛)
20楼2017-10-30 15:07:56
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