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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

[交流] 蛋白质的共价修饰的测定的试验方法----凌波丽 个人总结 已有7人参与

蛋白质的共价修饰的测定的试验方法
-------以糖基化修饰、有机小分子修饰和磷酸化修饰为例

凌波丽 个人总结

今天我看了几篇论坛里的有关的确认糖基和蛋白质中的氨基酸残基的侧链的结合位点的实验方法和有机分子共价修饰的蛋白质的质谱测定的试验方法的求助帖。我个人觉得：网友们的实验问题还是比较多，貌似没有人给出一些比较有代表性的试验方法的ideas,所以就螳螂挡臂，写了这个帖子，当是抛砖引玉吧。因为时间有限，我主要是谈一些比较有代表性的试验方法的ideas，至于其中实验细节，结合具体实验我们可以再讨论。

1.确定糖基和蛋白质结合位点的共价结合位点的方法。
方法很多，举例如下：
（1）基于NMR的方法。最简单的方法：可以用NMR解析结合糖基的蛋白质的完全的三维结构，要用自选量子数不为零的同位素加以标记（比如15N、13C）。能够直接获取糖蛋白的三级结构结构信息，包括糖基位点。
（2）基于质谱的方法。
实际上用串联质谱能够直接对于含有共价结合糖基的蛋白质进行测序，当然费用是较高的。要用串联质谱分析糖基化位点，不是貌似肽段谱图，而是貌似Ladder Sequencing，即Ediman降解结合质谱测定多肽序列，也就是用质谱代替凝胶电泳测定每一步Ediman降解之后减少一个氨基酸残基分子量的多肽段的相对分子量，但是现在能够用串联质谱直接测定多肽段的氨基酸序列了，不用在结合用Ediman降解。而且许多的多肽的糖基化、磷酸化、甲基化、乙酰化等各种共价的修饰，尤其是磷酸化修饰已经能够直接从质谱读出。
但是不幸的是糖分子不是线性分子，而是可能有很多分支。至少在分支位点必须用糖苷酶水解以确定分支的类型，目前的质谱还打不到能够区别糖链不同分支的水平。
（3）基于X-ray diffraction的方法。
用X-ray diffraction解析结合糖基的蛋白质的完全的三维结构，前提是能够获得结合糖基的蛋白质的单晶体。X-ray diffraction能够直接获取糖蛋白的三级结构结构信息，包括糖基位点。蛋白质的单晶体不一定必须只有一种单一的蛋白质，配体和受体相互作用的混合物也可能形成单晶体，比如核糖体的和小一段mRNA能形成单晶体并且用X-ray diffraction解析出原子水平的三维结构。
（4）基于肽谱分析的方法。事先要获得样品蛋白质的全序列（从数据库应该容易查到，实在没有再测序）；用强的螯合试剂夺取结合糖基的蛋白质中的糖基，得到脱糖基的蛋白质分子，然后用超滤除去螯合试剂和糖基，剩下脱糖基的蛋白质分子；分别用胰蛋白酶有限水解结合糖基的蛋白质和不结合结合糖基的蛋白质，分别过双向电泳，辨别出两次双向电泳图上位点不一样一样的多肽片段（能够读出相对分子量）的质谱峰；挖出位置不一样的两侧的电泳图上的肽斑回收其中肽段；对电泳图上位点不一样的多肽片段进行测序（Edman降解法即可，Edman降解法本身无法测定修饰的氨基酸，这本身也是一种信息）---------测定一部分知道多肽片段在整个序列中的位置即可，然后根据目的蛋白质的全序列中可能与糖基形成共价键的氨基酸的位点----在一级结构中的位置，判定出结合有糖基形成共价键的氨基酸的具体位点。

2.有机分子共价修饰的蛋白质的质谱测定的试验方法
以上用于糖基化测定的试验方法都可以用于有机分子（尤其是药物分子）共价修饰的蛋白质的质谱测定的试验方法。但是两者还有至少还有一点不同：糖基化在细胞里会正常存在，用酶完全去除不太容易，而有机分子（尤其是药物分子）共价修饰的蛋白质原来是不带有这类侧链基团的。所有两者的质谱测定方法并不相同。
对于一般的有机分子（尤其是药物分子）共价修饰的蛋白质的质谱测定。事先要获得样品蛋白质的全序列（从数据库应该容易查到，实在没有再测序）；分别用胰蛋白酶有限水解有机分子共价修饰蛋白质和还没有有机分子共价修饰蛋白质，分别过质谱，辨别出m/z不一样的多肽片段（能够读出相对分子量）的质谱峰；用分子筛层析分离出含有有机分子共价修饰和天然蛋白质分子质谱峰不一样的多肽片段（能够读出相对分子量）；取出以上质谱峰不一样的多肽片段（能够读出相对分子量），进行测序---------测定一部分知道多肽片段在整个序列中的位置即可，然后用串联质谱直接对于含有共价结合的有机分子的肽片段测序即可判定出结合有糖基形成共价键的氨基酸的具体位点（对比不含糖基的该段的质谱即可知道）。
当然因为有机分子共价修饰的的氨基酸我们还是能够确定的，所以直接用质谱测定时能够比较清楚地定位在有机分子共价修饰所在的肽片段，并用特异性的蛋白酶有限水解，得到蛋白质共价结合的有机分子所在的肽片段，然后走质谱，很容易确定分子量的变化和有机分子共价修饰的修饰位点。
我们现在甚至于不知道何种有机分子共价修饰了蛋白质，我们也可以通过质谱结合红外、紫外光谱而鉴定出共价修饰的有机分子的类型。

3.蛋白质的磷酸化检测。方法很多了：WB----现在有卖的磷酸化的蛋白质的单克隆抗体。双向电泳-----在磷酸化前后各做一次。质谱直接测定蛋白质的磷酸化的分子量变化。NMR测出磷酸化后的蛋白质的全构象。磷酸化的蛋白质的肽谱分析----先有限水解，再用二维电泳比较磷酸化前后的异常位置的肽斑。X-ray diffraction解析出磷酸化蛋白质的原子水平的全构象。


（仅供参考）

例1.求一个化合物对一种酶的抑制类型
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6048410
也可见：第15楼

例2.通过质谱的质量位移确定分子式
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6095316

[ Last edited by 凌波丽 on 2013-7-11 at 01:00 ]
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1楼 2013-06-21 02:56:15
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
加上第一个应用的实例：

例1.求一个化合物对一种酶的抑制类型

http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6048410

      本例强调了红外光谱和质谱在蛋白质的共价修饰的检测中的应用，和实际检测时的工作程序。

   本例的基本原理：“判定一个抑制剂对于某种酶是否为可逆抑制剂的试验方法”如下文所述，完整讨论请见原帖。

　　                   判定一个抑制剂对于某种酶是否为可逆抑制剂的试验方法

　　一个抑制剂对于酶是可逆抑制，还是不可逆抑制，判断方法不止一种。酶的不可逆抑制剂与酶分子的链接是共价连接，也就是说两者之间形成了新的共价键，而不是次级键。那么所有的用于蛋白质的共价修饰的研究技术也都可以适用于不可逆抑制剂对于酶分子的抑制作用。
　　首先要先行确定一个抑制剂对于某种酶是可逆抑制，还是不可逆抑制，比较简单的方法有：如果是该抑制剂对于酶是不可逆修饰剂，则有：1.对于加入抑制剂的酶-底物溶液（处于最适合酶促放映状态）的酶活力明显的降低；2.用红外傅里叶变换光谱仪检测加入对于加入抑制剂的酶-底物溶液（处于最适合酶促放映状态）的酶分子与同样条件下没有加入抑制剂的酶-底物溶液（处于最适合酶促反应状态）的酶分子相比较，有新的共价键形成。同时鉴别出此共价键不是没、底物、抑制剂所原有的共价键的红外傅里叶变换光谱。
　　然后用质谱检测酶促反应结束之后的酶分子的质量变大了即可确定了该酶的确受到了不可逆抑制剂的作用。
　　最后还可以质谱检测具体的不可逆修饰剂与酶分子的共价连接的位点，有限酶解有不可逆修饰剂修饰和无不可逆修饰剂修饰的同种酶，然后比较各个片段的相对分子量变化，然后再根据酶的一级结构的氨基酸序列中可能与抑制剂分子发生共价聚合的氨基酸侧链推测可能的结合位点，并且进一步缩小肽段，最后逐步逼近被修饰的氨基酸位点。
　　
　　以上情况是比较理想的情况，如果一个抑制剂对于某种酶是不可逆抑制，用红外傅里叶变换光谱仪检测加入对于加入抑制剂的酶-底物溶液（处于最适合酶促放映状态）的酶分子与同样条件下没有加入抑制剂的酶-底物溶液（处于最适合酶促反应状态）的酶分子相比较，不能判断出是否有新的共价键形成，比如形成的是与原先的酶或者底物或者抑制剂本身就有的固有共价键相同的新的共价键，此时就不能通过红外傅里叶变换光谱仪检测出新的共价键的特有吸收峰。但是又的确存在酶的活力受到抑制的情况，下面如何做？
　　直接用质谱检测酶促反应结束之后的酶分子的质量变大了即可确定了该酶的确受到了不可逆抑制剂的作用。
　　最后一步与前面一样，用质谱检测具体的不可逆修饰剂与酶分子的共价连接的位点，有限酶解有不可逆修饰剂修饰和无不可逆修饰剂修饰的同种酶，然后比较各个片段的相对分子量变化，然后再根据酶的一级结构的氨基酸序列中可能与抑制剂分子发生共价聚合的氨基酸侧链推测可能的结合位点，并且进一步缩小肽段，最后逐步逼近被修饰的氨基酸位点。
　　
　　以上用有限酶解候质谱检测的部分也可以改成“肽谱分析”------有限酶解蛋白质后，对于肽段走双向电泳。
　　
　　如果我们不放入底物进入酶溶液，直接加入抑制剂，然后重复以上两种检测过程行不行？这样做可以作为补充的实验，但是不能只用第三种方法。因为有些抑制剂，可能在没有酶促反应发生时，也不与酶共价结合，如同可逆制宜抑制的反竞争性抑制剂。
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15楼2013-07-06 12:37:53
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
蛋白质的共价修饰本身也是一种非常有效的试验方法，经常能够代替基因的点突变然后完成基因工程的全过程，尤其是对我这样的非常懒惰人非常有吸引力。
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2楼2013-06-21 03:01:33
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
我没有写糖蛋白和有机（药物）分子共价修饰的蛋白质的免疫检测方法，但实际上也是可用的，无非是制备出相应的单克隆抗体。

此三贴仅仅是凌波丽个人总结和抛砖引玉。
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3楼2013-06-21 03:07:40
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ynkuaile

木虫 (小有名气)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
myprayer: 金币+1, Gifts of roses, hand there are lingering fragrance. Look forward to your wonderful and more detailed answer. 2013-06-21 13:51:52
NMR, X-ray，质谱.(蛋白质磷酸化检测不说)，通过这几种方法来检测是否共价连接。最可行的是质谱，并且能分辨出连接位点。后续有可能的话才做NMR,X-ray。做结构的都知道，NMR结构解析需要多久的时间，X-ray晶体的生长需要多久的时间。万一解出结构不是自己想要的，那时间真的是浪费了。更别说NMR解不出结构，X-ray长不出晶体，那毕业就难喽。觉得可行的就是质谱。当然，判断共价还有其他办法，但没那么通用。
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5楼2013-06-21 11:16:12
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