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求一个化合物对一种酶的抑制类型
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| 给位虫虾，请教一下。我想求一个化合物对一种酶的抑制类型，想通过动力学的方法求出。书本指出可以通过初速率对酶浓度做图。目前我没有那个酶的标准品，可否通过使用不同体积的酶样品用量来替代酶标准品定量相对浓度？ |
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 蛋白质生物学实验经验 |
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13楼2013-07-11 20:44:45
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判定一个抑制剂对于某种酶是否为可逆抑制剂的试验方法 一个抑制剂对于酶是可逆抑制，还是不可逆抑制，判断方法不止一种。酶的不可逆抑制剂与酶分子的链接是共价连接，也就是说两者之间形成了新的共价键，而不是次级键。那么所有的用于蛋白质的共价修饰的研究技术也都可以适用于不可逆抑制剂对于酶分子的抑制作用。 首先要先行确定一个抑制剂对于某种酶是可逆抑制，还是不可逆抑制，比较简单的方法有：如果是该抑制剂对于酶是不可逆修饰剂，则有：1.对于加入抑制剂的酶-底物溶液（处于最适合酶促放映状态）的酶活力明显的降低；2.用红外傅里叶变换光谱仪检测加入对于加入抑制剂的酶-底物溶液（处于最适合酶促放映状态）的酶分子与同样条件下没有加入抑制剂的酶-底物溶液（处于最适合酶促反应状态）的酶分子相比较，有新的共价键形成。同时鉴别出此共价键不是没、底物、抑制剂所原有的共价键的红外傅里叶变换光谱。 然后用质谱检测酶促反应结束之后的酶分子的质量变大了即可确定了该酶的确受到了不可逆抑制剂的作用。 最后还可以质谱检测具体的不可逆修饰剂与酶分子的共价连接的位点，有限酶解有不可逆修饰剂修饰和无不可逆修饰剂修饰的同种酶，然后比较各个片段的相对分子量变化，然后再根据酶的一级结构的氨基酸序列中可能与抑制剂分子发生共价聚合的氨基酸侧链推测可能的结合位点，并且进一步缩小肽段，最后逐步逼近被修饰的氨基酸位点。 以上情况是比较理想的情况，如果一个抑制剂对于某种酶是不可逆抑制，用红外傅里叶变换光谱仪检测加入对于加入抑制剂的酶-底物溶液（处于最适合酶促放映状态）的酶分子与同样条件下没有加入抑制剂的酶-底物溶液（处于最适合酶促反应状态）的酶分子相比较，不能判断出是否有新的共价键形成，比如形成的是与原先的酶或者底物或者抑制剂本身就有的固有共价键相同的新的共价键，此时就不能通过红外傅里叶变换光谱仪检测出新的共价键的特有吸收峰。但是又的确存在酶的活力受到抑制的情况，下面如何做？ 直接用质谱检测酶促反应结束之后的酶分子的质量变大了即可确定了该酶的确受到了不可逆抑制剂的作用。 最后一步与前面一样，用质谱检测具体的不可逆修饰剂与酶分子的共价连接的位点，有限酶解有不可逆修饰剂修饰和无不可逆修饰剂修饰的同种酶，然后比较各个片段的相对分子量变化，然后再根据酶的一级结构的氨基酸序列中可能与抑制剂分子发生共价聚合的氨基酸侧链推测可能的结合位点，并且进一步缩小肽段，最后逐步逼近被修饰的氨基酸位点。 以上用有限酶解候质谱检测的部分也可以改成“肽谱分析”------有限酶解蛋白质后，对于肽段走双向电泳。 可以参考：蛋白质的共价修饰的测定的试验方法----凌波丽 个人总结 http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6034049 如果我们不放入底物进入酶溶液，直接加入抑制剂，然后重复以上两种检测过程行不行？这样做可以作为补充的实验，但是不能只用第三种方法。因为有些抑制剂，可能在没有酶促反应发生时，也不与酶共价结合，如同可逆制宜抑制的反竞争性抑制剂。 |
12楼2013-07-06 12:29:54
小毛孩24
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【答案】应助回帖
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wizardfan: 金币+5, 谢谢详细的回答 2013-06-27 07:05:34
shuanghao1: 金币+20 2013-07-01 10:21:19
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shuanghao1: 金币+20 2013-07-01 10:21:19
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用倒数作图就可以知道是可逆抑制反应还是不可逆抑制反应。 不可以通过使用不同体积的酶样品用量来替代酶标准品定量相对浓度，因为每一次加大酶的浓度的同时，也同时放大了反应体积，这样用倒数作图就会有较大误差，如果只用v-time作图，曲线究竟会变成什么样很难说！如果你同时加大底物浓度和抑制剂浓度，表面上是同步放大反应体系，但是其中的动力学过程也同样很难说会使反应曲线到底如何变化。 你就把酶的活力测一下，然后标出活力单位也不难呀。 |
6楼2013-06-26 23:07:05
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10楼2013-07-05 11:20:06
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