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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求一个化合物对一种酶的抑制类型
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shuanghao1

金虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-07-05 11:20:06
你不问的话，我的回答就到6楼截止了，你既然问了，我就会继续讨论。我去找找有没有不用扫描能够发上来的电子版酶的抑制动力学鉴定，如果没有那就借别人的书扫描几页酶的抑制动力学鉴定的内容。...

O(∩_∩)O谢谢，因为我看到的是倒数图区别是哪种类型的可逆抑制剂。
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11楼2013-07-05 16:14:25
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
　　判定一个抑制剂对于某种酶是否为可逆抑制剂的试验方法
　　
　　一个抑制剂对于酶是可逆抑制，还是不可逆抑制，判断方法不止一种。酶的不可逆抑制剂与酶分子的链接是共价连接，也就是说两者之间形成了新的共价键，而不是次级键。那么所有的用于蛋白质的共价修饰的研究技术也都可以适用于不可逆抑制剂对于酶分子的抑制作用。
　　首先要先行确定一个抑制剂对于某种酶是可逆抑制，还是不可逆抑制，比较简单的方法有：如果是该抑制剂对于酶是不可逆修饰剂，则有：1.对于加入抑制剂的酶-底物溶液（处于最适合酶促放映状态）的酶活力明显的降低；2.用红外傅里叶变换光谱仪检测加入对于加入抑制剂的酶-底物溶液（处于最适合酶促放映状态）的酶分子与同样条件下没有加入抑制剂的酶-底物溶液（处于最适合酶促反应状态）的酶分子相比较，有新的共价键形成。同时鉴别出此共价键不是没、底物、抑制剂所原有的共价键的红外傅里叶变换光谱。
　　然后用质谱检测酶促反应结束之后的酶分子的质量变大了即可确定了该酶的确受到了不可逆抑制剂的作用。
　　最后还可以质谱检测具体的不可逆修饰剂与酶分子的共价连接的位点，有限酶解有不可逆修饰剂修饰和无不可逆修饰剂修饰的同种酶，然后比较各个片段的相对分子量变化，然后再根据酶的一级结构的氨基酸序列中可能与抑制剂分子发生共价聚合的氨基酸侧链推测可能的结合位点，并且进一步缩小肽段，最后逐步逼近被修饰的氨基酸位点。
　　
　　以上情况是比较理想的情况，如果一个抑制剂对于某种酶是不可逆抑制，用红外傅里叶变换光谱仪检测加入对于加入抑制剂的酶-底物溶液（处于最适合酶促放映状态）的酶分子与同样条件下没有加入抑制剂的酶-底物溶液（处于最适合酶促反应状态）的酶分子相比较，不能判断出是否有新的共价键形成，比如形成的是与原先的酶或者底物或者抑制剂本身就有的固有共价键相同的新的共价键，此时就不能通过红外傅里叶变换光谱仪检测出新的共价键的特有吸收峰。但是又的确存在酶的活力受到抑制的情况，下面如何做？
　　直接用质谱检测酶促反应结束之后的酶分子的质量变大了即可确定了该酶的确受到了不可逆抑制剂的作用。
　　最后一步与前面一样，用质谱检测具体的不可逆修饰剂与酶分子的共价连接的位点，有限酶解有不可逆修饰剂修饰和无不可逆修饰剂修饰的同种酶，然后比较各个片段的相对分子量变化，然后再根据酶的一级结构的氨基酸序列中可能与抑制剂分子发生共价聚合的氨基酸侧链推测可能的结合位点，并且进一步缩小肽段，最后逐步逼近被修饰的氨基酸位点。
　　
　　以上用有限酶解候质谱检测的部分也可以改成“肽谱分析”------有限酶解蛋白质后，对于肽段走双向电泳。

    可以参考：蛋白质的共价修饰的测定的试验方法----凌波丽 个人总结
    http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6034049
　　
　　如果我们不放入底物进入酶溶液，直接加入抑制剂，然后重复以上两种检测过程行不行？这样做可以作为补充的实验，但是不能只用第三种方法。因为有些抑制剂，可能在没有酶促反应发生时，也不与酶共价结合，如同可逆制宜抑制的反竞争性抑制剂。
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12楼2013-07-06 12:29:54
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MaoNaiJi

金虫 (正式写手)
如果只是判断可逆还是不可逆 要做一系列直线 看它们是否过圆点 还是一组平行线 横坐标酶液体积 纵坐标吸光值或者反应速率
参见 王镜岩生物化学第3版上册P370 图9-18
双倒数作图是进一步判断 可逆抑制作用里面的竞争性 非竞争性等的
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13楼2013-07-11 20:44:45
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MaoNaiJi

金虫 (正式写手)
打错了 横坐标是酶浓度 可以在体系里增加酶液体积 同时减少缓冲液体积 保持总体积不变
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14楼2013-07-11 20:48:13
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shuanghao1

金虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by MaoNaiJi at 2013-07-11 20:44:45
如果只是判断可逆还是不可逆 要做一系列直线 看它们是否过圆点 还是一组平行线 横坐标酶液体积 纵坐标吸光值或者反应速率
参见 王镜岩生物化学第3版上册P370 图9-18
双倒数作图是进一步判断 可逆抑制作用里面的竞 ...

13楼主回答到了重点，太感谢你了
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15楼2013-07-12 07:02:42
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zhouxj

至尊木虫 (文坛精英)
引用回帖:
13楼: Originally posted by MaoNaiJi at 2013-07-11 20:44:45
如果只是判断可逆还是不可逆 要做一系列直线 看它们是否过圆点 还是一组平行线 横坐标酶液体积 纵坐标吸光值或者反应速率
参见 王镜岩生物化学第3版上册P370 图9-18
双倒数作图是进一步判断 可逆抑制作用里面的竞 ...

是的 我也一直这样做，可好像还有不同意见 请继续讨论
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16楼2013-09-03 16:34:37
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zhouxj

至尊木虫 (文坛精英)
引用回帖:
14楼: Originally posted by MaoNaiJi at 2013-07-11 20:48:13
打错了 横坐标是酶浓度 可以在体系里增加酶液体积 同时减少缓冲液体积 保持总体积不变

没错 保持总体积不变
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17楼2013-09-03 16:35:16
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