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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 为什么pET载体要有lac操纵子？？？
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xissy

铜虫 (小有名气)

[求助] 为什么pET载体要有lac操纵子？？？ 已有1人参与

有的pET载体有lac操纵子，例如实验室最常用的pET28a，也有的pET载体没有lac操纵子，例如pET17b。我不是特别明白这里lac操纵子的意义，姑且解释一下，请各位大侠指正下。
     lac操纵子紧邻T7启动子的下游，它带有常规启动子和可以编码lac阻遏蛋白的序列。lac阻遏蛋白一方面作用于宿主染色体lacUV5启动子，抑制宿主聚合酶转录T7 RNA聚合酶，一方面也作用于载体本身的T7启动子，最终的目的在于阻断任何形式的T7 RNA聚合酶导致的目的基因的转录。诱导时加入IPTG，IPTG是乳糖类似物，可以与阻遏蛋白lacI结合，改变其结构，从而激活转录。也就是说如果pET载体没有lac操纵子，其本底表达会比较严重。
     是这样解释的吗？？？
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1楼 2014-10-19 15:29:00
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602059625

金虫 (知名作家)
★ ★ ★
gyesang: 金币+3, 鼓励交流！ 2014-10-19 23:30:38
为了降低basal expression，pET28载体上T7启动子的下游还加了一段lac operator序列
pET载体表达需要有IPTG诱导，以解除对基因组上lacUV5启动子的阻遏，以及pET载体上lac operator的阻遏



来源：pET system manual
          http://www.emdmillipore.com/life ... s1O77QAAAEhPqsLdcab
基因组上的lacUV5启动子控制T7 RNA polymerase gene的表达

来源：http://www.emdmillipore.com/showBrochure/201001.195.ProNet.pdf
另外pET28载体上还有一个组成型表达的lacI基因，其作用是增加lacI阻遏物的表达量，因为pET28载体以多拷贝存在，仅靠基因组上的lacI基因无法产生足够多的lacI阻遏物

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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2楼2014-10-19 19:10:38
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luca5s

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励交流！ 2014-10-19 23:31:17
xissy: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-10-20 21:33:11
如果没有阻遏蛋白，那么菌液就会自己表达，那么，表达的蛋白会影响菌的活性，更重要的是，表达的话，就无法进行传代扩增培养了。有这样一个调控，是非常方便而且实用的，在我们需要的时候才能进行表达。
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咳咳
3楼2014-10-19 19:57:40
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602059625

金虫 (知名作家)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-10-19 23:33:38
为了降低basal expression，pET28载体上T7启动子的下游还加了一段lac operator序列
pET载体表达需要有IPTG诱导，以解除对基因组上lacUV5启动子的阻遏，以及pET载体上lac operator的阻遏



来源：pET system manual
          http://www.emdmillipore.com/life ... s1O77QAAAEhPqsLdcab
基因组上的lacUV5启动子控制T7 RNA polymerase gene的表达
http://image.keyan.cc/data/bcs/2 ... _1399474503_469.png
来源：http://www.emdmillipore.com/showBrochure/201001.195.ProNet.pdf
另外pET28载体上还有一个组成型表达的lacI基因，其作用是增加lacI阻遏物的表达量，因为pET28载体以多拷贝存在，仅靠基因组上的lacI基因无法产生足够多的lacI阻遏物
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xissy
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4楼2014-10-19 20:16:13
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602059625

金虫 (知名作家)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-10-19 23:34:05
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5楼2014-10-19 20:17:08
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xissy

铜虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by 602059625 at 2014-10-19 20:16:13
为了降低basal expression，pET28载体上T7启动子的下游还加了一段lac operator序列
pET载体表达需要有IPTG诱导，以解除对基因组上lacUV5启动子的阻遏，以及pET载体上lac operator的阻遏
http://image.keyan.cc/da ...

本来想给您评分的，结果显示你的评论不是应助回帖，所以就只能送一朵红花了。对于您的回答，我还有几点疑问。
还是以pET28a质粒为例。
1.其启动子就叫做T7lac启动子，这是对T7启动子和lac operator中lac启动子的概称吗？
2.您说，“pET28载体上还有一个组成型表达的lacI基因”，这里的lacI基因指的就是lac operator里的lacI吗？
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6楼2014-10-20 21:37:33
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xissy

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 602059625 at 2014-10-19 20:16:13
为了降低basal expression，pET28载体上T7启动子的下游还加了一段lac operator序列
pET载体表达需要有IPTG诱导，以解除对基因组上lacUV5启动子的阻遏，以及pET载体上lac operator的阻遏
http://image.keyan.cc/da ...

继续问。
加入IPTG的目的是为了解除lacI阻遏蛋白对T7lac和宿主lacUV5的抑制作用。如果载体没有lac操纵子，例如pET17b，是否意味着不需要加入IPTG，即该蛋白是组成型表达的呢？
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7楼2014-10-20 21:55:43
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602059625

金虫 (知名作家)
引用回帖:
6楼: Originally posted by xissy at 2014-10-20 21:37:33
本来想给您评分的，结果显示你的评论不是应助回帖，所以就只能送一朵红花了。对于您的回答，我还有几点疑问。
还是以pET28a质粒为例。
1.其启动子就叫做T7lac启动子，这是对T7启动子和lac operator中lac启动子的 ...

lac operon
lac operator
1.只是构建载体的人取的名字而已
2.你把pET载体上的lacI序列跟大肠杆菌基因组上的lacI比对一下，会发现这两个一模一样
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8楼2014-10-20 22:19:54
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602059625

金虫 (知名作家)
引用回帖:
7楼: Originally posted by xissy at 2014-10-20 21:55:43
继续问。
加入IPTG的目的是为了解除lacI阻遏蛋白对T7lac和宿主lacUV5的抑制作用。如果载体没有lac操纵子，例如pET17b，是否意味着不需要加入IPTG，即该蛋白是组成型表达的呢？...

加IPTG主要是解除整合在大肠杆菌基因组上的DE3里的控制T7RNA聚合酶表达的lac promoter的阻遏
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9楼2014-10-20 22:24:24
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