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gu666hong

银虫 (小有名气)

[求助] 体外转录RNA，为什么会出现2条带 已有1人参与

最近做了体外转录RNA实验，质粒用的PGEM-4Z，先用Nde Ⅰ单酶切1h线性化，然后转录RNA 2h，然后加DNase Ⅰ 37℃ 1h去除模板，
然后跑琼脂糖胶鉴定，结果出现2条带

单酶切体系：NdeⅠ1μL buffer G 1μL 质粒6μL DEPC水2μL ；10μL
转录体系：5*T7buffer 10μL，单切后质粒10μL，T7酶2μL，RRI 2μL，NTP 4μL,DEPC水 22μL；50μL

体外转录RNA，为什么会出现2条带
Administrator 2014-10-09 10hr 04min.jpg
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1楼 2014-10-10 08:37:32
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-10-11 15:44:57
你这个是什么agarose gel？
RNA变性没有？RNA的高级结构可能产生多条条带。
建议走Urea-PAGE再看，如果RNA太大，甲醛变性agarose gel
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2楼2014-10-10 19:28:21
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gu666hong

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by biostar2009 at 2014-10-10 19:28:21
你这个是什么agarose gel？
RNA变性没有？RNA的高级结构可能产生多条条带。
建议走Urea-PAGE再看，如果RNA太大，甲醛变性agarose gel

我用的是一般的琼脂糖胶，RNA变性一般是70摄氏度5min，然后跑胶，因为之前转录过一次，只有一条带，这次是过了一个月又转的，失败了。你说的Urea-PAGE没做过，甲醛变性胶我可以尝试下，只是marker我用DNA的么？我这没有RNA的marker。另外想问下，RNA要多大用Urea-PAGE，多大用甲醛变性胶，我的RNA转录的大小也就500多bp
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3楼2014-10-11 10:32:31
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gu666hong

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by biostar2009 at 2014-10-10 19:28:21
你这个是什么agarose gel？
RNA变性没有？RNA的高级结构可能产生多条条带。
建议走Urea-PAGE再看，如果RNA太大，甲醛变性agarose gel

我用变形胶已经跑完了，但是还是有2条带。哎，不知道转录哪里出了问题了
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4楼2014-10-11 15:41:47
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by gu666hong at 2014-10-11 15:41:47
我用变形胶已经跑完了，但是还是有2条带。哎，不知道转录哪里出了问题了...

甲醛变性的？loading也是用的甲醛变性的loading？还是之前转录过只有一条带的？模板换过没？
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5楼2014-10-11 18:30:04
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gu666hong

银虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by biostar2009 at 2014-10-11 18:30:04
甲醛变性的？loading也是用的甲醛变性的loading？还是之前转录过只有一条带的？模板换过没？...

对，是甲醛变性的，我是按照宝生物的一个方法做的甲醛变性电泳，具体配的体系是20微升：样品5微升，甲醛3.5微升，甲酰胺4微升，5*MOPS 4微升，6*loading 3.0微升 DEPC水0.5微升。之前转录过是一条带，模板换过，因为之前8月份提的质粒用完了，我又拿出保的菌复苏，提的质粒。
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6楼2014-10-11 20:03:21
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)
★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-10-12 22:55:57
引用回帖:
6楼: Originally posted by gu666hong at 2014-10-11 20:03:21
对，是甲醛变性的，我是按照宝生物的一个方法做的甲醛变性电泳，具体配的体系是20微升：样品5微升，甲醛3.5微升，甲酰胺4微升，5*MOPS 4微升，6*loading 3.0微升 DEPC水0.5微升。之前转录过是一条带，模板换过，因 ...

这怪事了！500 nt Urea-PAGE有点不合适，6%可能都高，你们若不做这个，也麻烦。
那怎办？质粒测序？
看样子你这个差的还挺远的，
你这样，把你的质粒，在T7前面不太远的地方，再找个酶切一刀，看看掉下来的片段有几条
要是还只有一条，那算是出鬼了。。。
看看你变性胶的结果
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7楼2014-10-11 22:34:14
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gu666hong

银虫 (小有名气)
我是打算质粒重新测序的，可是还是要做验证啊。我打算质粒先单切2个不同位点，这2个再做一次相同限制酶单切，跑胶看看2个切开后大小，再说，不知道行不？你说的想法和我差不多，明天先做做看吧

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8楼2014-10-11 22:45:16
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gu666hong

银虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by gu666hong at 2014-10-11 22:45:16
我是打算质粒重新测序的，可是还是要做验证啊。我打算质粒先单切2个不同位点，这2个再做一次相同限制酶单切，跑胶看看2个切开后大小，再说，不知道行不？你说的想法和我差不多，明天先做做看吧
...

变性胶结果明天我再发，今天刚回来，不在电脑旁边

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9楼2014-10-11 22:47:04
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gu666hong

银虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by biostar2009 at 2014-10-11 22:34:14
这怪事了！500 nt Urea-PAGE有点不合适，6%可能都高，你们若不做这个，也麻烦。
那怎办？质粒测序？
看样子你这个差的还挺远的，
你这样，把你的质粒，在T7前面不太远的地方，再找个酶切一刀，看看掉下来的片段 ...

这两天有事外出一直不在实验室，上传的变形胶图片，泳道3、4、5是转的RNA,6是DNAmarker2000,1是DNAmarker2000,2跑的一个RNA marker1000（借的别人的），效果很不好。另外的我的质粒已经送去测序了，等结果中，
体外转录RNA，为什么会出现2条带-1
Administrator 2014-10-11 18hr 43min.jpg
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10楼2014-10-15 21:24:29
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