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汕头大学海洋科学接受调剂
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gu666hong

银虫 (小有名气)

[求助] 体外转录RNA,为什么会出现2条带 已有1人参与

最近做了体外转录RNA实验,质粒用的PGEM-4Z,先用Nde Ⅰ单酶切1h线性化,然后转录RNA 2h,然后加DNase Ⅰ 37℃ 1h去除模板,
然后跑琼脂糖胶鉴定,结果出现2条带

单酶切体系:NdeⅠ1μL buffer G 1μL 质粒6μL DEPC水2μL ;10μL
转录体系:5*T7buffer 10μL,单切后质粒10μL,T7酶2μL,RRI 2μL,NTP 4μL,DEPC水 22μL;50μL

体外转录RNA,为什么会出现2条带
Administrator 2014-10-09 10hr 04min.jpg
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2014-10-11 15:44:57
你这个是什么agarose gel?
RNA变性没有?RNA的高级结构可能产生多条条带。
建议走Urea-PAGE再看,如果RNA太大,甲醛变性agarose gel
2楼2014-10-10 19:28:21
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gu666hong

银虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by biostar2009 at 2014-10-10 19:28:21
你这个是什么agarose gel?
RNA变性没有?RNA的高级结构可能产生多条条带。
建议走Urea-PAGE再看,如果RNA太大,甲醛变性agarose gel

我用的是一般的琼脂糖胶,RNA变性一般是70摄氏度5min,然后跑胶,因为之前转录过一次,只有一条带,这次是过了一个月又转的,失败了。你说的Urea-PAGE没做过,甲醛变性胶我可以尝试下,只是marker我用DNA的么?我这没有RNA的marker。另外想问下,RNA要多大用Urea-PAGE,多大用甲醛变性胶,我的RNA转录的大小也就500多bp
3楼2014-10-11 10:32:31
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gu666hong

银虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by biostar2009 at 2014-10-10 19:28:21
你这个是什么agarose gel?
RNA变性没有?RNA的高级结构可能产生多条条带。
建议走Urea-PAGE再看,如果RNA太大,甲醛变性agarose gel

我用变形胶已经跑完了,但是还是有2条带。哎,不知道转录哪里出了问题了
4楼2014-10-11 15:41:47
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by gu666hong at 2014-10-11 15:41:47
我用变形胶已经跑完了,但是还是有2条带。哎,不知道转录哪里出了问题了...

甲醛变性的?loading也是用的甲醛变性的loading?还是之前转录过只有一条带的?模板换过没?
5楼2014-10-11 18:30:04
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gu666hong

银虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by biostar2009 at 2014-10-11 18:30:04
甲醛变性的?loading也是用的甲醛变性的loading?还是之前转录过只有一条带的?模板换过没?...

对,是甲醛变性的,我是按照宝生物的一个方法做的甲醛变性电泳,具体配的体系是20微升:样品5微升,甲醛3.5微升,甲酰胺4微升,5*MOPS 4微升,6*loading 3.0微升 DEPC水0.5微升。之前转录过是一条带,模板换过,因为之前8月份提的质粒用完了,我又拿出保的菌复苏,提的质粒。
6楼2014-10-11 20:03:21
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)

★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-10-12 22:55:57
引用回帖:
6楼: Originally posted by gu666hong at 2014-10-11 20:03:21
对,是甲醛变性的,我是按照宝生物的一个方法做的甲醛变性电泳,具体配的体系是20微升:样品5微升,甲醛3.5微升,甲酰胺4微升,5*MOPS 4微升,6*loading 3.0微升 DEPC水0.5微升。之前转录过是一条带,模板换过,因 ...

这怪事了!500 nt Urea-PAGE有点不合适,6%可能都高,你们若不做这个,也麻烦。
那怎办?质粒测序?
看样子你这个差的还挺远的,
你这样,把你的质粒,在T7前面不太远的地方,再找个酶切一刀,看看掉下来的片段有几条
要是还只有一条,那算是出鬼了。。。
看看你变性胶的结果
7楼2014-10-11 22:34:14
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gu666hong

银虫 (小有名气)

我是打算质粒重新测序的,可是还是要做验证啊。我打算质粒先单切2个不同位点,这2个再做一次相同限制酶单切,跑胶看看2个切开后大小,再说,不知道行不?你说的想法和我差不多,明天先做做看吧

[ 发自小木虫客户端 ]
8楼2014-10-11 22:45:16
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gu666hong

银虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by gu666hong at 2014-10-11 22:45:16
我是打算质粒重新测序的,可是还是要做验证啊。我打算质粒先单切2个不同位点,这2个再做一次相同限制酶单切,跑胶看看2个切开后大小,再说,不知道行不?你说的想法和我差不多,明天先做做看吧
...

变性胶结果明天我再发,今天刚回来,不在电脑旁边

[ 发自小木虫客户端 ]
9楼2014-10-11 22:47:04
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gu666hong

银虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by biostar2009 at 2014-10-11 22:34:14
这怪事了!500 nt Urea-PAGE有点不合适,6%可能都高,你们若不做这个,也麻烦。
那怎办?质粒测序?
看样子你这个差的还挺远的,
你这样,把你的质粒,在T7前面不太远的地方,再找个酶切一刀,看看掉下来的片段 ...

这两天有事外出一直不在实验室,上传的变形胶图片,泳道3、4、5是转的RNA,6是DNAmarker2000,1是DNAmarker2000,2跑的一个RNA marker1000(借的别人的),效果很不好。另外的我的质粒已经送去测序了,等结果中,
体外转录RNA,为什么会出现2条带-1
Administrator 2014-10-11 18hr 43min.jpg

10楼2014-10-15 21:24:29
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