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汕头大学海洋科学接受调剂
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gu666hong

银虫 (小有名气)

[求助] 体外转录RNA,为什么会出现2条带 已有1人参与

最近做了体外转录RNA实验,质粒用的PGEM-4Z,先用Nde Ⅰ单酶切1h线性化,然后转录RNA 2h,然后加DNase Ⅰ 37℃ 1h去除模板,
然后跑琼脂糖胶鉴定,结果出现2条带

单酶切体系:NdeⅠ1μL buffer G 1μL 质粒6μL DEPC水2μL ;10μL
转录体系:5*T7buffer 10μL,单切后质粒10μL,T7酶2μL,RRI 2μL,NTP 4μL,DEPC水 22μL;50μL

体外转录RNA,为什么会出现2条带
Administrator 2014-10-09 10hr 04min.jpg
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gu666hong

银虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by gu666hong at 2014-10-11 22:45:16
我是打算质粒重新测序的,可是还是要做验证啊。我打算质粒先单切2个不同位点,这2个再做一次相同限制酶单切,跑胶看看2个切开后大小,再说,不知道行不?你说的想法和我差不多,明天先做做看吧
...

变性胶结果明天我再发,今天刚回来,不在电脑旁边

[ 发自小木虫客户端 ]
9楼2014-10-11 22:47:04
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2014-10-11 15:44:57
你这个是什么agarose gel?
RNA变性没有?RNA的高级结构可能产生多条条带。
建议走Urea-PAGE再看,如果RNA太大,甲醛变性agarose gel
2楼2014-10-10 19:28:21
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gu666hong

银虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by biostar2009 at 2014-10-10 19:28:21
你这个是什么agarose gel?
RNA变性没有?RNA的高级结构可能产生多条条带。
建议走Urea-PAGE再看,如果RNA太大,甲醛变性agarose gel

我用的是一般的琼脂糖胶,RNA变性一般是70摄氏度5min,然后跑胶,因为之前转录过一次,只有一条带,这次是过了一个月又转的,失败了。你说的Urea-PAGE没做过,甲醛变性胶我可以尝试下,只是marker我用DNA的么?我这没有RNA的marker。另外想问下,RNA要多大用Urea-PAGE,多大用甲醛变性胶,我的RNA转录的大小也就500多bp
3楼2014-10-11 10:32:31
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gu666hong

银虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by biostar2009 at 2014-10-10 19:28:21
你这个是什么agarose gel?
RNA变性没有?RNA的高级结构可能产生多条条带。
建议走Urea-PAGE再看,如果RNA太大,甲醛变性agarose gel

我用变形胶已经跑完了,但是还是有2条带。哎,不知道转录哪里出了问题了
4楼2014-10-11 15:41:47
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