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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » pcr实验中遇到的问题，求指导
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悠悠飘杨

新虫 (小有名气)

[求助] pcr实验中遇到的问题，求指导 已有3人参与

我的pcr实验每次都要p两次，才能得到想要的结果，请问这会不会对后续的克隆实验有影响？而且我的pcr结果总是不稳定，相同条件下不能得到一样的结果，请问这该怎么办？
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1楼 2014-09-04 09:05:09
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huyan0817

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
悠悠飘杨(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-09-04 19:31:10
P两次很正常，只要是扩增条带与目标条带差不多，应该问题不大。至于不稳定我不知道楼主所谓的不稳定是指什么情况，可以说详细点！
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2楼2014-09-04 09:48:48
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悠悠飘杨

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by huyan0817 at 2014-09-04 09:48:48
P两次很正常，只要是扩增条带与目标条带差不多，应该问题不大。至于不稳定我不知道楼主所谓的不稳定是指什么情况，可以说详细点！

就是同样的条件，再去做pcr，就得不到一样的结果，条带的位置都不一样，甚至都没有条带，而且杂带的位置也不一样
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3楼2014-09-04 10:22:55
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huyan0817

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
悠悠飘杨(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-09-04 19:31:20
引用回帖:
3楼: Originally posted by 悠悠飘杨 at 2014-09-04 10:22:55
就是同样的条件，再去做pcr，就得不到一样的结果，条带的位置都不一样，甚至都没有条带，而且杂带的位置也不一样...

你这个有点奇怪哦!有杂条带说明你引物有非特异性扩增,建议楼主把所有东西换一下,该灭菌的从新灭一次,模板少加点,跑电泳时候用1%胶及电压小点80V，PCR退火温度适当提高几度！
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4楼2014-09-04 13:22:33
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悠悠飘杨

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by huyan0817 at 2014-09-04 13:22:33
你这个有点奇怪哦!有杂条带说明你引物有非特异性扩增,建议楼主把所有东西换一下,该灭菌的从新灭一次,模板少加点,跑电泳时候用1%胶及电压小点80V，PCR退火温度适当提高几度！...

我在想会不会是引物的问题，引物的特异性不够好
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5楼2014-09-04 13:52:40
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哇哇乱叫

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
悠悠飘杨(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-09-04 19:31:31
就是引物的特异性太差了，pcr就那几个点容易出问题。大部分就是引物的问题，有时候pcr体系也会有影响，但是你每次读是一样的所以应该不是体系问题。
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时间会证明一切
6楼2014-09-04 13:55:23
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悠悠飘杨

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 哇哇乱叫 at 2014-09-04 13:55:23
就是引物的特异性太差了，pcr就那几个点容易出问题。大部分就是引物的问题，有时候pcr体系也会有影响，但是你每次读是一样的所以应该不是体系问题。

有一次p出来目的条带了，是做梯度pcr的时候，但是再做就得不到结果了
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7楼2014-09-04 13:58:31
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a314919473

银虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
这个影响因素比较多，换个酶试试，或者简单点买个预混液，你只要加入引物、模板、水就可以了。
祝顺利
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有你真好
8楼2014-09-04 16:49:04
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悠悠飘杨

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by a314919473 at 2014-09-04 16:49:04
这个影响因素比较多，换个酶试试，或者简单点买个预混液，你只要加入引物、模板、水就可以了。
祝顺利

那用mix，会不会影响后续的克隆
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9楼2014-09-05 08:31:50
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huyan0817

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by 悠悠飘杨 at 2014-09-04 13:52:40
我在想会不会是引物的问题，引物的特异性不够好...

嗯!可以提高温度来提高特异性或者从新设计引物
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10楼2014-09-05 09:46:38
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