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aabbwestone

银虫 (初入文坛)

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[求助] 毕赤酵母ppic9k表达原理问题已有2人参与

问题1：His4有什么用，是用来做酵母的筛选还是？
问题2: amp和kan各有什么用。
问题3：是否可以用单酶切MCS来做线性化。

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rightbackinthewater

1楼2014-09-01 10:58:40

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aabbwestone

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引用回帖:

2楼: Originally posted by Dearstar at 2014-09-02 09:27:39
问题1：His4有什么用，是用来做酵母的筛选还是？
毕赤酵母菌株GS115及KM71都是在组氨酸脱氢酶位点（HIS4）有突变，因而不能合成组氨酸，而所有的有表达的质粒都有HIS4基因，可以与宿主进行互补，通过不含组氨酸的平 ...

非常感谢，还有两个问题，表达的蛋白怎么纯化；用5AOX1和HIS做线性化是否都可以

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rightbackinthewater

4楼2014-09-02 17:18:08

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Dearstar

新虫 (小有名气)

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【答案】应助回帖

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aabbwestone: 金币+10, ★★★很有帮助 2014-09-02 17:14:14
gyesang: 金币+5, 鼓励回帖交流！ 2014-09-03 18:38:14

问题1：His4有什么用，是用来做酵母的筛选还是？
毕赤酵母菌株GS115及KM71都是在组氨酸脱氢酶位点（HIS4）有突变，因而不能合成组氨酸，而所有的有表达的质粒都有HIS4基因，可以与宿主进行互补，通过不含组氨酸的平板培养基来筛选转化子。
问题2: amp和kan各有什么用。
kan基因序列，在当这个质粒是转化入大肠杆菌中时，它是具有kan抗性，而当它被转化入毕赤酵母中时，它不是形成的kan抗性，而是形成的遗传酶素抗性，即我们常说的(G418)，可以对其进行多拷贝子插入子的筛选。amp的抗性基因也是在将质粒转化入大肠的时候使用的。
问题3：是否可以用单酶切MCS来做线性化。
这个我个人觉得应该是不是可以的，因为MCS本来就是多克隆位点，构建这个质粒就是在此处插入目的基因，便于产生多克隆的，如果在此处线性化，我怀疑会影响线性化后的DNA与毕赤酵母DNA的结合，导致转化失败。你在在单克隆位点线性化载体啊，这样插入毕赤酵母的基因组中，产生mut+或者muts重组子不是更好么。

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