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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 毕赤酵母ppic9k表达原理问题
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aabbwestone

银虫 (初入文坛)

[求助] 毕赤酵母ppic9k表达原理问题 已有2人参与

问题1：His4有什么用，是用来做酵母的筛选还是？
问题2: amp和kan各有什么用。
问题3：是否可以用单酶切MCS来做线性化。
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rightbackinthewater
1楼 2014-09-01 10:58:40
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aabbwestone

银虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by Dearstar at 2014-09-02 09:27:39
问题1：His4有什么用，是用来做酵母的筛选还是？
毕赤酵母菌株GS115及KM71都是在组氨酸脱氢酶位点（HIS4）有突变，因而不能合成组氨酸，而所有的有表达的质粒都有HIS4基因，可以与宿主进行互补，通过不含组氨酸的平 ...

你好，关于毕赤酵母表达还有一个问题，如果质粒线性化后转化宿主后质粒又自连成环状而不是整合到染色体中，这样的转化子应该也可以筛选，这样是不是假阳性。非常感谢！
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rightbackinthewater
8楼2014-09-10 16:09:37
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Dearstar

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
aabbwestone: 金币+10, ★★★很有帮助 2014-09-02 17:14:14
gyesang: 金币+5, 鼓励回帖交流！ 2014-09-03 18:38:14
问题1：His4有什么用，是用来做酵母的筛选还是？
毕赤酵母菌株GS115及KM71都是在组氨酸脱氢酶位点（HIS4）有突变，因而不能合成组氨酸，而所有的有表达的质粒都有HIS4基因，可以与宿主进行互补，通过不含组氨酸的平板培养基来筛选转化子。
问题2: amp和kan各有什么用。
kan基因序列，在当这个质粒是转化入大肠杆菌中时，它是具有kan抗性，而当它被转化入毕赤酵母中时，它不是形成的kan抗性，而是形成的遗传酶素抗性，即我们常说的(G418)，可以对其进行多拷贝子插入子的筛选。amp的抗性基因也是在将质粒转化入大肠的时候使用的。
问题3：是否可以用单酶切MCS来做线性化。
这个我个人觉得应该是不是可以的，因为MCS本来就是多克隆位点，构建这个质粒就是在此处插入目的基因，便于产生多克隆的，如果在此处线性化，我怀疑会影响线性化后的DNA与毕赤酵母DNA的结合，导致转化失败。你在在单克隆位点线性化载体啊，这样插入毕赤酵母的基因组中，产生mut+或者muts重组子不是更好么。
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aabbwestone
2楼2014-09-02 09:27:39
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sierjing

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你好：
      我也想做毕赤酵母表达的，请问是自己实验室还是在公司购买的
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3楼2014-09-02 15:32:20
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aabbwestone

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Dearstar at 2014-09-02 09:27:39
问题1：His4有什么用，是用来做酵母的筛选还是？
毕赤酵母菌株GS115及KM71都是在组氨酸脱氢酶位点（HIS4）有突变，因而不能合成组氨酸，而所有的有表达的质粒都有HIS4基因，可以与宿主进行互补，通过不含组氨酸的平 ...

非常感谢，还有两个问题，表达的蛋白怎么纯化；用5AOX1和HIS做线性化是否都可以
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rightbackinthewater
4楼2014-09-02 17:18:08
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