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miaoshuang

银虫 (小有名气)

[求助] 荧光定量PCR相关问题 已有1人参与

各位大神:
        在做荧光定量PCR时,,我每个基因的重复数设为4,但4个重复的CT值总是相差太大,这是怎么回事呀?
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yzj926521

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
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kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-08-31 19:49:44
加样误差大,加样的时候没有混匀
我做3个重复时候保证ct误差小于0.2
2楼2014-08-30 08:39:30
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bwangel

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-08-31 19:49:48
重复间差距大就是加样的问题,样的多少对结果影响很大的,可能的话最好混合后分装
3楼2014-08-30 14:27:54
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令狐少陈

铜虫 (小有名气)

★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-08-31 19:49:52
你的重复指什么啊,生物学重复还是加样重复?
加样重复的话一般要求Ct相差不超过0.5,如果相差很大,你可以将酶,引物,和水提前预混,再一起加到模版里,减少加样次数引起的误差。用新一点的强,慢慢加,吸进去的样品尽量全部打出来!
如果是生物学重复那就太正常啦!
多多交流,海纳百川
4楼2014-08-30 15:53:49
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爬爬大蜗牛

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


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kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2014-08-31 19:49:56
记的把模板和mix或者模板和水混合然后分装,单独一个一个加模板,误差会大4
5楼2014-08-30 16:20:19
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖


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kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2014-08-31 19:50:01
加样不准,技术重复不好
6楼2014-08-31 09:19:03
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baoyu166

禁虫 (初入文坛)

感谢参与,应助指数 +1
本帖内容被屏蔽

7楼2014-09-01 10:26:57
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double可

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
是先预混体系,加样之后瞬时离心。
早已不承认还有什么神
8楼2014-09-01 12:54:55
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miaoshuang

银虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by 爬爬大蜗牛 at 2014-08-30 16:20:19
记的把模板和mix或者模板和水混合然后分装,单独一个一个加模板,误差会大4

可不可以把模板、引物、MiX等所有东西混合后再分装?
努力,勇敢向前走,一切皆有可能
9楼2014-09-02 17:22:08
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wwjcas570

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

除大家说的以上原因外,你看一下溶解曲线,如果不是单一的峰,引物不好,即使加样一样,也会导致重复性不好,其次要避免污染。
10楼2014-09-02 18:10:01
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