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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 荧光定量PCR相关问题
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miaoshuang

银虫 (小有名气)

[求助] 荧光定量PCR相关问题 已有1人参与

各位大神：
        在做荧光定量PCR时，，我每个基因的重复数设为4，但4个重复的CT值总是相差太大，这是怎么回事呀？
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努力，勇敢向前走，一切皆有可能
1楼 2014-08-29 22:16:04
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yzj926521

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
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kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-08-31 19:49:44
加样误差大，加样的时候没有混匀
我做3个重复时候保证ct误差小于0.2
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2楼2014-08-30 08:39:30
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bwangel

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-08-31 19:49:48
重复间差距大就是加样的问题，样的多少对结果影响很大的，可能的话最好混合后分装
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3楼2014-08-30 14:27:54
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令狐少陈

铜虫 (小有名气)
★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-08-31 19:49:52
你的重复指什么啊，生物学重复还是加样重复?
加样重复的话一般要求Ct相差不超过0.5，如果相差很大，你可以将酶，引物，和水提前预混，再一起加到模版里，减少加样次数引起的误差。用新一点的强，慢慢加，吸进去的样品尽量全部打出来！
如果是生物学重复那就太正常啦！
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多多交流，海纳百川
4楼2014-08-30 15:53:49
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爬爬大蜗牛

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2014-08-31 19:49:56
记的把模板和mix或者模板和水混合然后分装，单独一个一个加模板，误差会大4
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5楼2014-08-30 16:20:19
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2014-08-31 19:50:01
加样不准，技术重复不好
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6楼2014-08-31 09:19:03
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baoyu166

禁虫 (初入文坛)
感谢参与，应助指数 +1
本帖内容被屏蔽
7楼2014-09-01 10:26:57
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double可

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
是先预混体系，加样之后瞬时离心。
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早已不承认还有什么神
8楼2014-09-01 12:54:55
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miaoshuang

银虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 爬爬大蜗牛 at 2014-08-30 16:20:19
记的把模板和mix或者模板和水混合然后分装，单独一个一个加模板，误差会大4

可不可以把模板、引物、MiX等所有东西混合后再分装？
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努力，勇敢向前走，一切皆有可能
9楼2014-09-02 17:22:08
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wwjcas570

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

除大家说的以上原因外，你看一下溶解曲线，如果不是单一的峰，引物不好，即使加样一样，也会导致重复性不好，其次要避免污染。
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10楼2014-09-02 18:10:01
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