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汕头大学海洋科学接受调剂
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lilongping

新虫 (正式写手)

[求助] 长片段克隆用invitrogen公司试剂盒问题求助 已有3人参与

最近用PCR扩增得到6.5k左右条带,想做做长片段PCR克隆,用Invitrogen公司的TOPO® XL PCR Cloning试剂盒做了一次克隆:按照这个试剂盒操作说明,片段4ul 连接1ul 载体,25℃,30min后,转化到TOP 10 感受态,在卡拉霉素抗性平板上过夜培养后,生长了大概有200左右的克隆,我挑取24个之后用M13F-M13R引物做菌落PCR,但是,检测的结果非常奇怪:有很多条带,大家看看这个是什么原因,哪里出问题了啊?
我连接的PCR片段是条带单一的,浓度为26ng/ul。

图片最中间的是全式金15k的DNA分子量Marker

长片段克隆用invitrogen公司试剂盒问题求助
2014-08-17 长片段克隆检测G,H;.jpg
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trizol11

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
lilongping(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-08-18 15:47:00
你扩增的时候有问题吧?我觉得,6500的条带貌似就出现俩个,你修改一下反应程序,在扩一次,长片段的程序要摸索一下
任重道远……
3楼2014-08-18 15:37:29
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
lilongping(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-08-18 15:46:48
条带这么多?而且最底下的都大小不一。
你把扩出目的片段的质粒酶切鉴定一下看看对不对。有时候菌液PCR也不一定咋样。
2楼2014-08-18 15:26:09
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BioChen

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你的阴性对照(TOP10菌液)和阳性对照(目的PCR片段)呢?
学会control!!!
4楼2014-08-18 17:11:19
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lilongping

新虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-08-18 15:26:09
条带这么多?而且最底下的都大小不一。
你把扩出目的片段的质粒酶切鉴定一下看看对不对。有时候菌液PCR也不一定咋样。

我又做了一次长片段克隆,看看长不,如果长了的话,我再挑一些做完PCR鉴定,如果结果还是这样,我就提取质粒再酶切鉴定吧,谢谢啦
5楼2014-08-18 22:37:54
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