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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 长片段克隆用invitrogen公司试剂盒问题求助
汕头大学海洋科学接受调剂
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lilongping

新虫 (正式写手)

[求助] 长片段克隆用invitrogen公司试剂盒问题求助 已有3人参与

最近用PCR扩增得到6.5k左右条带，想做做长片段PCR克隆，用Invitrogen公司的TOPO® XL PCR Cloning试剂盒做了一次克隆：按照这个试剂盒操作说明，片段4ul 连接1ul 载体，25℃，30min后，转化到TOP 10 感受态，在卡拉霉素抗性平板上过夜培养后，生长了大概有200左右的克隆，我挑取24个之后用M13F-M13R引物做菌落PCR,但是，检测的结果非常奇怪：有很多条带，大家看看这个是什么原因，哪里出问题了啊？
我连接的PCR片段是条带单一的，浓度为26ng/ul。

图片最中间的是全式金15k的DNA分子量Marker

长片段克隆用invitrogen公司试剂盒问题求助
2014-08-17 长片段克隆检测G,H;.jpg
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1楼 2014-08-17 21:33:08
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
lilongping(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-08-18 15:46:48
条带这么多？而且最底下的都大小不一。
你把扩出目的片段的质粒酶切鉴定一下看看对不对。有时候菌液PCR也不一定咋样。
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2楼2014-08-18 15:26:09
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trizol11

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
lilongping(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-08-18 15:47:00
你扩增的时候有问题吧？我觉得，6500的条带貌似就出现俩个，你修改一下反应程序，在扩一次，长片段的程序要摸索一下
赞一下 回复此楼
任重道远……
3楼2014-08-18 15:37:29
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BioChen

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你的阴性对照（TOP10菌液）和阳性对照（目的PCR片段）呢？
学会control！！！
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4楼2014-08-18 17:11:19
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lilongping

新虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-08-18 15:26:09
条带这么多？而且最底下的都大小不一。
你把扩出目的片段的质粒酶切鉴定一下看看对不对。有时候菌液PCR也不一定咋样。

我又做了一次长片段克隆，看看长不，如果长了的话，我再挑一些做完PCR鉴定，如果结果还是这样，我就提取质粒再酶切鉴定吧，谢谢啦
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5楼2014-08-18 22:37:54
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lilongping

新虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by trizol11 at 2014-08-18 15:37:29
你扩增的时候有问题吧？我觉得，6500的条带貌似就出现俩个，你修改一下反应程序，在扩一次，长片段的程序要摸索一下

是啊，不知道为啥会有2个6500左右的条带呢？ 我菌液PCR的时候用的反应程序和当时扩增长片段的时候的PCR程序是一样的啊
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6楼2014-08-18 22:39:36
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by lilongping at 2014-08-18 22:37:54
我又做了一次长片段克隆，看看长不，如果长了的话，我再挑一些做完PCR鉴定，如果结果还是这样，我就提取质粒再酶切鉴定吧，谢谢啦...

不客气
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7楼2014-08-19 14:37:38
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