应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 长片段克隆用invitrogen公司试剂盒问题求助
71/1返回列表
查看: 1434  |  回复: 6
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

lilongping

新虫 (正式写手)

[求助] 长片段克隆用invitrogen公司试剂盒问题求助 已有3人参与

最近用PCR扩增得到6.5k左右条带，想做做长片段PCR克隆，用Invitrogen公司的TOPO® XL PCR Cloning试剂盒做了一次克隆：按照这个试剂盒操作说明，片段4ul 连接1ul 载体，25℃，30min后，转化到TOP 10 感受态，在卡拉霉素抗性平板上过夜培养后，生长了大概有200左右的克隆，我挑取24个之后用M13F-M13R引物做菌落PCR,但是，检测的结果非常奇怪：有很多条带，大家看看这个是什么原因，哪里出问题了啊？
我连接的PCR片段是条带单一的，浓度为26ng/ul。

图片最中间的是全式金15k的DNA分子量Marker

长片段克隆用invitrogen公司试剂盒问题求助
2014-08-17 长片段克隆检测G,H;.jpg
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2014-08-17 21:33:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
lilongping(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-08-18 15:46:48
条带这么多？而且最底下的都大小不一。
你把扩出目的片段的质粒酶切鉴定一下看看对不对。有时候菌液PCR也不一定咋样。
赞一下 回复此楼
2楼2014-08-18 15:26:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

trizol11

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
lilongping(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-08-18 15:47:00
你扩增的时候有问题吧？我觉得，6500的条带貌似就出现俩个，你修改一下反应程序，在扩一次，长片段的程序要摸索一下
赞一下 回复此楼
任重道远……
3楼2014-08-18 15:37:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

BioChen

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你的阴性对照（TOP10菌液）和阳性对照（目的PCR片段）呢？
学会control！！！
赞一下 回复此楼
4楼2014-08-18 17:11:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lilongping

新虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-08-18 15:26:09
条带这么多？而且最底下的都大小不一。
你把扩出目的片段的质粒酶切鉴定一下看看对不对。有时候菌液PCR也不一定咋样。

我又做了一次长片段克隆，看看长不，如果长了的话，我再挑一些做完PCR鉴定，如果结果还是这样，我就提取质粒再酶切鉴定吧，谢谢啦
赞一下 回复此楼
5楼2014-08-18 22:37:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lilongping

新虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by trizol11 at 2014-08-18 15:37:29
你扩增的时候有问题吧？我觉得，6500的条带貌似就出现俩个，你修改一下反应程序，在扩一次，长片段的程序要摸索一下

是啊，不知道为啥会有2个6500左右的条带呢？ 我菌液PCR的时候用的反应程序和当时扩增长片段的时候的PCR程序是一样的啊
赞一下 回复此楼
6楼2014-08-18 22:39:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by lilongping at 2014-08-18 22:37:54
我又做了一次长片段克隆，看看长不，如果长了的话，我再挑一些做完PCR鉴定，如果结果还是这样，我就提取质粒再酶切鉴定吧，谢谢啦...

不客气
回复此楼
7楼2014-08-19 14:37:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 lilongping 的主题更新
71/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 316求调剂 +7 梁茜雯 2026-03-19 7/350 2026-03-23 16:21 by lingjue
[考研] 一志愿重庆大学085700资源与环境，总分308求调剂 +6 墨墨漠 2026-03-23 7/350 2026-03-23 16:09 by 墨墨漠
[考研] 085600材料与化工 +10 安全上岸！ 2026-03-16 10/500 2026-03-23 09:31 by Jy?
[考研] 307求调剂 +11 冷笙123 2026-03-17 11/550 2026-03-22 20:16 by edmund7
[考研] 08工科 320总分 求调剂 +11 梨花珞晚风 2026-03-17 11/550 2026-03-22 17:42 by luoyongfeng
[考研] 308求调剂 +3 墨墨漠 2026-03-21 3/150 2026-03-22 16:54 by i_cooler
[考研] 306求调剂 +5 来好运来来来 2026-03-22 5/250 2026-03-22 16:17 by BruceLiu320
[考研] 275求调剂 +6 shansx 2026-03-22 8/400 2026-03-22 15:27 by barlinike
[考研] 303求调剂 +5 安忆灵 2026-03-22 6/300 2026-03-22 12:46 by 素颜倾城1988
[考研] 0805 316求调剂 +3 大雪深藏 2026-03-18 3/150 2026-03-21 18:55 by 学员8dgXkO
[考研] 求调剂 +3 13341 2026-03-20 3/150 2026-03-21 18:28 by 学员8dgXkO
[考研] 297求调剂 +11 戏精丹丹丹 2026-03-17 12/600 2026-03-21 17:47 by ColorlessPI
[考研] 265求调剂 +3 Jack?k?y 2026-03-17 3/150 2026-03-21 03:17 by JourneyLucky
[考研] 一志愿 西北大学 ，070300化学学硕，总分287，双非一本，求调剂。 +3 晨昏线与星海 2026-03-18 3/150 2026-03-21 00:46 by JourneyLucky
[考研] 304求调剂 +6 曼殊2266 2026-03-18 6/300 2026-03-21 00:32 by JourneyLucky
[考研] A区线材料学调剂 +5 周周无极 2026-03-20 5/250 2026-03-20 21:33 by laoshidan
[考研] 一志愿西安交通大学 学硕 354求调剂211或者双一流 +3 我想要读研究生 2026-03-20 3/150 2026-03-20 20:13 by JourneyLucky
[考研] 320求调剂0856 +3 不想起名字112 2026-03-19 3/150 2026-03-19 22:53 by 学员8dgXkO
[考研] 本科郑州大学物理学院，一志愿华科070200学硕，346求调剂 +4 我不是一根葱 2026-03-18 4/200 2026-03-19 09:11 by 浮云166
[考研] 333求调剂 +3 文思客 2026-03-16 7/350 2026-03-16 18:21 by 文思客
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭