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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 分类/鉴定 » 关于芽孢杆菌16S rRNA鉴定的疑问
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zoeye

金虫 (小有名气)

[求助] 关于芽孢杆菌16S rRNA鉴定的疑问 已有2人参与

我想用PCR的方法鉴定几种芽孢杆菌

枯草芽孢杆菌  
我在NCBI的Nucleotide里直接输Bacillus subtills直接弹出来的就是【Bacillus subtilis strain N7 16S ribosomal RNA gene, partial sequence】
我是直接在这个序列上设计引物就能P出我要的枯草芽孢杆菌吗
因为我不太清楚我的枯草到底是哪种亚型

我还要鉴定  苏云金芽孢杆菌
在Nucleotide输入Bacillus thuringiensis 直接弹出来的是【Bacillus thuringiensis VipS gene, complete cds】的序列
这个序列可以特异性的鉴定苏云金吗？？
直接弹出的结果是不是表示没有16s rRNA的序列呢？

我还要鉴定蜡样芽孢杆菌
但在NCBI里面搜关键词 结果有很多 其中有个【Bacillus cereus NC7401 genomic DNA, complete genome】
我可以在里面找到16S的序列直接设计引物做PCR鉴定我的蜡样芽孢杆菌吗？

小女子不是学微生物的
现在需要鉴定
有很多困惑
还希望各位前辈多多指点

我只用生理生化的方法鉴定到某个种
是不是只有到亚种才能PCR啊？
还有 我是在一个混合的环境微生物里面筛这些
培养的方法貌似不是很靠谱
我确定所有样本里面都有 但是并不是所有的样本都可以培养的出来
希望各位大神献计献策

谢谢
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1楼 2014-08-04 08:54:55
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zhaozhibozhi

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

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zoeye: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-08-05 08:37:17
貌似芽孢杆菌一些种的16s序列几乎完全一致，如果是想设计特异性引物区别这三个种的话，需要对它们的序列进行比对，在差异区域设计各个种的特异引物（不太清楚这三个钟16s序列差异多大）。

特异性pcr只能提供一个初步的证据（基于16s序列的特异性引物需要好好考虑了，因为16s序列还是相当保守的）。你可以查阅相关文献，基于其它基因或序列的特异性引物应该是存在的。

如果是对16s进行测序的话，有几对16s保守引物的，如27f/1492r。但是对芽孢杆菌来说，仅根据16s序列是很难鉴定到种的。需要结合其它证据，如MLSA。
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做一个阳光、开朗的小和尚
4楼2014-08-05 08:36:03
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zhaozhibozhi

金虫 (正式写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by zoeye at 2014-08-06 09:42:48
4个种的特异性引物是指直接在基因组上P吗？
微生物的基因组之间的差异大嘛?...

加点背景：从分类上而言，细菌特定群体（属、种、亚种、血清型、致病变种或者某个种下的某个群体等等）表现为一系列相似的特征，理论上可以用特定的指标将其与其它细菌区分开来。

所谓特异性引物，是根据微生物基因组序列的差异（某个基因或片段）设计引物，电泳检测PCR片段时，只有供试微生物才能出现目的片段，而其它任何近缘、远缘微生物都不能扩增到目的片段。

设计特异性引物，特异是重点。一般先在序列数据库中检测其特异性（如NCBI-Primer BLAST），还要拿近缘物种的扩增结果验证其特异性。当然，适于你的样品的一套程序肯定得建立起来（包括样品处理方法、PCR体系和反应程序等）。这方面的文章很多。

你的问题：“基因组上P？”——PCR体系中，需要模版DNA（微生物特异性PCR，一般需要基因组作模版）。你可能需要提取DNA，或者简单的微生物破壁过程就可以了（破坏细胞壁，释放DNA。如沸水浴）。

“微生物基因组差异”——有很多保守的区域，但有相当一部分区别很大（根据亲缘关系）。具体多大，不同物种相比较，结果是不同的；很难给个准确数值。不同物种进行DNA-DNA杂交，相似度基本<70%。有时，同一种下不同群体之间都会有相当大的差异的。总之，差异是有的。
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做一个阳光、开朗的小和尚
12楼2014-08-06 15:33:16
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zhuyundi

新虫 (初入文坛)
感谢参与，应助指数 +1
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2楼2014-08-04 15:29:37
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zoeye

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhuyundi at 2014-08-04 15:29:37
需要鉴定这块的话，你可以电话联系我，已发你私信

我已经知道了具体亚种
如何可以知道鉴定这种亚种特定的16S rRNA引物呢？
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3楼2014-08-04 15:35:34
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zoeye

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by zhaozhibozhi at 2014-08-05 08:36:03
貌似芽孢杆菌一些种的16s序列几乎完全一致，如果是想设计特异性引物区别这三个种的话，需要对它们的序列进行比对，在差异区域设计各个种的特异引物（不太清楚这三个钟16s序列差异多大）。

特异性pcr只能提供一个 ...

我找到了16S rRNA的序列先肥西可变区和保守区吗？
我将NCBI里面的16S rRNA全长进行Blast 我的目的菌种的相似度是100%
其他都是按照99%依次往下的相似度排列的
那我可以P这个16S的全长来鉴定吗
我关注的是4个菌 这4个菌相似度很高
但在NCBI里面BLAST全长 都是只有一个100% 其中还有一个100%是炭疽芽胞杆菌 这个显然不是我要的
那我可以P全长来鉴定吗？

期待您的回复

PS:MLSA是什么？我搜了文献 有的是P一个基因 比如 有的文献写的利用gyrA基因鉴定枯草芽孢杆菌？ 我就想问了 不是所有菌都有这个基因吗？而且gyrA基因鉴定的竟然是枯草杆菌属吗？ 不是某个亚型？怎么听起来那么不靠谱呢？
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5楼2014-08-05 08:43:38
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zoeye

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by zhaozhibozhi at 2014-08-05 08:36:03
貌似芽孢杆菌一些种的16s序列几乎完全一致，如果是想设计特异性引物区别这三个种的话，需要对它们的序列进行比对，在差异区域设计各个种的特异引物（不太清楚这三个钟16s序列差异多大）。

特异性pcr只能提供一个 ...

我找到了16S rRNA的序列区别可变区和保守区吗？软件？

我将NCBI里面的16S rRNA全长进行Blast 我的目的菌种的相似度是100%
其他都是按照99%依次往下的相似度排列的
那我可以P这个16S的全长来鉴定吗
我关注的是4个菌 这4个菌相似度很高
但在NCBI里面BLAST全长 都是只有一个100% 其中还有一个100%是炭疽芽胞杆菌 这个显然不是我要的
那我可以P全长来鉴定吗？

期待您的回复

PS:MLSA是什么？我搜了文献 有的是P一个基因 比如 有的文献写的利用gyrA基因鉴定枯草芽孢杆菌？ 我就想问了 不是所有菌都有这个基因吗？而且gyrA基因鉴定的竟然是枯草杆菌属吗？ 不是某个亚型？怎么听起来那么不靠谱呢？
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6楼2014-08-05 09:03:08
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zhaozhibozhi

金虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by zoeye at 2014-08-05 09:03:08
我找到了16S rRNA的序列区别可变区和保守区吗？软件？

我将NCBI里面的16S rRNA全长进行Blast 我的目的菌种的相似度是100%
其他都是按照99%依次往下的相似度排列的
那我可以P这个16S的全长来鉴定吗
我关注的是 ...

首先，你的目的？

如果是在不存在其它任何环境微生物存在的情况下，仅为了区别这四种菌，任何生化或序列的差异都是可行的。如果4个菌16s序列有差异，可以在差异区域设计引物，以区别之。因为16s序列的高度保守性，Bacillus某些种的序列极相似，有时仅1-2碱基差异，仅通过PCR产物有无或片段大小可能不太可行。当然，可以近全长测序（27F/1492r）,通过序列比对来区分。

PS: MLSA是结合多个保守基因（gyrA是一个保守housekeeping gene）。想通过单个基因（比如16s、比如gyrA）鉴定到种，通常是不太靠谱的。
难道你说的“亚型”是species，subspecies？？？
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做一个阳光、开朗的小和尚
7楼2014-08-05 09:44:26
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zoeye

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7楼: Originally posted by zhaozhibozhi at 2014-08-05 09:44:26
首先，你的目的？

如果是在不存在其它任何环境微生物存在的情况下，仅为了区别这四种菌，任何生化或序列的差异都是可行的。如果4个菌16s序列有差异，可以在差异区域设计引物，以区别之。因为16s序列的高度保守性 ...

我的目的是在一个混个样本中检测我的目的微生物
比如我怀疑牙周病人的唾液中都含有这种菌 所以我就搜集了所有唾液 想进行PCR大量验证其他样本
这四种菌是我分离培养出来的
但是培养的方法缺陷太大 不是所有样本都可以培养的出来
但我肯定所有样本里都是有的
所以就是在一个存在着许多微生物的环境下 鉴定这四种
他们不都是属于芽孢杆菌属吗？
这个属没有特异的引物可以借鉴吗？
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8楼2014-08-05 14:27:24
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zoeye

金虫 (小有名气)
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7楼: Originally posted by zhaozhibozhi at 2014-08-05 09:44:26
首先，你的目的？

如果是在不存在其它任何环境微生物存在的情况下，仅为了区别这四种菌，任何生化或序列的差异都是可行的。如果4个菌16s序列有差异，可以在差异区域设计引物，以区别之。因为16s序列的高度保守性 ...

对 我说的亚型是种下的亚型 比图 枯草芽孢杆菌的Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168
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9楼2014-08-05 14:28:34
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zhaozhibozhi

金虫 (正式写手)
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8楼: Originally posted by zoeye at 2014-08-05 14:27:24
我的目的是在一个混个样本中检测我的目的微生物
比如我怀疑牙周病人的唾液中都含有这种菌 所以我就搜集了所有唾液 想进行PCR大量验证其他样本
这四种菌是我分离培养出来的
但是培养的方法缺陷太大 不是所有样本 ...

这样的话，最好查阅文献，找到已知的4个种的特异性引物。根据16S序列，可能不够特异。
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做一个阳光、开朗的小和尚
10楼2014-08-05 18:42:32
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