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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于16S rRNA基因绝对荧光定量的问题
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lemian

木虫 (正式写手)

[求助] 关于16S rRNA基因绝对荧光定量的问题 已有1人参与

虫友们，我想请教一个问题。
我有一批样品做了16S rRNA基因V3-V5区高通量测序，得到了一个OTU相对丰度矩阵。然后我用绝对荧光定量做了16S rRNA基因V4区的分析，得到了原始DNA 16S rRNA基因的拷贝数。我想能不能在每个样品中用OTU相对丰度乘以荧光定量获得的该样品的拷贝数，最终能不能得到一个OTU绝对丰度的矩阵。然后用于后续分析，如alpha多样性beta多样性等。
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1楼 2013-12-03 09:27:26
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lemian

木虫 (正式写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by ice-bamboo at 2014-06-14 10:57:45
请问大侠：您的“绝对荧光定量做了16S rRNA基因V4区的分析”中的标准曲线是怎么做的啊？我看文献中是用“reference bacteria”但却不知道他们是怎么选参考菌的。

标曲前半部分是别人帮做的。大概是拿细菌样品去扩16s v4区，然后导入质粒，转入大肠杆菌，挑单克隆测序。然后将此单克隆扩大培养以后提取质粒DNA,然后用分光测DNA浓度，然后再剃度稀释该DNA，以此为模版去做定量pcr就是标曲了。

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11楼2014-06-15 15:51:57
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lemian

木虫 (正式写手)
有人知道吗？
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2楼2013-12-03 11:34:02
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lemian

木虫 (正式写手)
哎，每人给个建议
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3楼2013-12-03 19:01:05
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xiadongliang

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lemian: 金币+1, ★有帮助 2013-12-04 23:19:18
lemian: 金币+4 2013-12-04 23:19:54
多样性你直接采用高通量测序得到的OTU相对丰度就可以了。
那个绝对拷贝数没必要用。
OTU相对丰度乘以荧光定量获得的该样品的拷贝数也就是绝对风度再计算多样性跟相对丰度计算式一样的，只是多了一个拷贝数而已。在计算多样性的时候分子分母会除掉，没有什么实际意义。
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4楼2013-12-04 10:48:42
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lemian

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by xiadongliang at 2013-12-04 10:48:42
多样性你直接采用高通量测序得到的OTU相对丰度就可以了。
那个绝对拷贝数没必要用。
OTU相对丰度乘以荧光定量获得的该样品的拷贝数也就是绝对风度再计算多样性跟相对丰度计算式一样的，只是多了一个拷贝数而已。在 ...

我还要分析不同OTU之间的相关关系，例如OTU1和OTU2的线性相关关系。如果用相对丰度去做结果可能会不准，因为OTU1 在两个样品中可能相对丰度不变，但绝对丰度有非常大的变化。所以我想问一下我拿相对丰度去乘拷贝数这方法是否可行，会不会遭到质疑。

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5楼2013-12-04 12:59:43
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xiadongliang

金虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by lemian at 2013-12-04 12:59:43
我还要分析不同OTU之间的相关关系，例如OTU1和OTU2的线性相关关系。如果用相对丰度去做结果可能会不准，因为OTU1 在两个样品中可能相对丰度不变，但绝对丰度有非常大的变化。所以我想问一下我拿相对丰度去乘拷贝数 ...

相对丰度不变，绝对丰度怎么会变？我有点儿想不明白。
不过你那样相乘应该没啥问题。
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6楼2013-12-04 13:23:25
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lemian

木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by xiadongliang at 2013-12-04 13:23:25
相对丰度不变，绝对丰度怎么会变？我有点儿想不明白。
不过你那样相乘应该没啥问题。...

感谢你的回答！
举个例子，A样品有100个细菌，细菌1的相对丰度是10％。B样品有1000个细菌，细菌1的相对丰度也是10％。如果用相对丰度，细菌1在A样品和B样品间是没有变化的，但实际上细菌1的丰度是上升的。
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7楼2013-12-04 23:10:40
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xiadongliang

金虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by lemian at 2013-12-04 23:10:40
感谢你的回答！
举个例子，A样品有100个细菌，细菌1的相对丰度是10％。B样品有1000个细菌，细菌1的相对丰度也是10％。如果用相对丰度，细菌1在A样品和B样品间是没有变化的，但实际上细菌1的丰度是上升的。...

这个我知道。是细菌总量上的差别。
但是计算多样性指数可能差别不大。你可以先试试看。
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8楼2013-12-05 12:04:56
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lemian

木虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by xiadongliang at 2013-12-05 12:04:56
这个我知道。是细菌总量上的差别。
但是计算多样性指数可能差别不大。你可以先试试看。...

好的，非常感谢你！

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9楼2013-12-09 12:42:31
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ice-bamboo

木虫 (小有名气)
请问大侠：您的“绝对荧光定量做了16S rRNA基因V4区的分析”中的标准曲线是怎么做的啊？我看文献中是用“reference bacteria”但却不知道他们是怎么选参考菌的。
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生为科研
10楼2014-06-14 10:57:45
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